肝细胞性肝癌是目前世界上最常见的,癌症致死率第二位的恶性肿瘤,全世界每年以新增75000例的速度不断增长。早期研究证实,如癌基因的激活与抑癌基因的失活等功能异常与肝癌的发生发展密切相关；随着研究进一步深入,非编码RNA在基因表达调控中的作用逐渐受到人们的关注,非编码RNA的结构变异和调节异常能够导致包括肿瘤在内的各种疾病,并且其在肝癌发生发展中的发挥的作用也是目前研究的新的热点。在人类基因组中,参与编码蛋白的RNA仅占人类基因组总序列的2%,这说明将近90%以上的转录子是非编码RNA(noncoding RNA, ncRNA):包括微小、RNA (microRNA, miRNA)和长链非编码RNA (long noncoding RNAs, lncRNAs)。LncRN A是一类在基因组转录过程中广泛存在,并且长度超过200个核苷酸的一类转录产物的总称,它们具有多种特有的生物学功能并能通过不同的机制参与各种生物进程：如表观遗传学调控、转录、翻译、剪接、细胞周期调控、诱导细胞分化等。近期研究证实lncRNA分子的变异和功能异常能够导致包括肝癌在内的各种疾病的发生。lncRNA是一个“多面手”,几乎参与基因调控的每一个环节,从表观遗传学修饰到mRNA剪切再到RNA转录和翻译,在其中任何一个环节的功能异常都有可能对肝癌的发生发展产生：1)lncRNA启动子区域甲基化异常。2)基因印记缺失。3) "miRNA海绵”作用。4)在启动子区域通过介导PRC2与其靶点的结合,并作为转录沉默因子的辅抑制物,阻止下游抑癌基因的转录。因此,越来越多与肝癌相关的lncRNA被发现,如H19、MALAT1、UCA1、uc.338、 MEG3、HULC、HEIH和MVIH等。除了癌基因与抑癌基因的功能异常能直接导致肿瘤的发生,表观遗传学改变在肿瘤发生发展过程中同样发挥了重要作用。早期研究证实抑癌基因启动子区域高甲基化能直接引起其表达水平的降低,从而导致肿瘤的发生。与之相同的是编码IncRNA启动子区域的甲基化异常也是肿瘤发生的重要原因,同时可能导致肿瘤的转移。但是,目前国内外对于启动子甲基化与IncRNA在肝癌中表达调控的作用以及肝癌发生发展的机制研究相对稀少。结合IncRNA在肝癌发生发展过程中功能研究不足的现状,我们通过联合lncRNA表达谱芯片以及启动子芯片共同筛选、验证,找到了由表观遗传学(启动子甲基化)调控的与肝癌发生发展特异相关的IncRNA,同时通过研究其相关下游基因的改变,旨在探究lncRNA自身调控及其与靶基因组成的与肝癌发生发展相关的复杂调节网络机制。本研究从IncRNA上游启动子区域到下游编码基因分析肝癌发生发展的相关机制,从新的角度阐明肝癌发生发展的分子机制,对发现新的肝癌特异性分子标志物和肝癌治疗的新靶点有重要的理论和实践意义。第一部分肝癌相关启动子高甲基化IncRNA的筛选目的：表观遗传学改变是肝癌发生发展的重要原因,启动子甲基化程度与基因表达水平高低密切相关。LncRNA表达谱芯片目前已被国内外广泛应用,而lncRNA启动子区域甲基化研究近年才开展。本部分研究通过联合lncRNA表达谱芯片及启动子芯片,旨在筛选在乙肝相关性肝癌早期患者肝癌组织及癌旁组织中存在差异表达,并且启动子区域高甲基化的特异性lncRNA。方法：本研究中采用美国Arraystar公司luman LncRNA Microarray v20表达谱芯片Human 2.1M LncRNA Promoter Microarray启动子芯片,对2011年10月-12月期间在复旦大学附属中山医院就诊,最终确诊为乙肝相关性早期肝细胞性肝癌的8例患者的肝癌组织和癌旁组织样本进行检测。表达谱芯片涵盖了通过从世界上最权威的数据库如RefSeq, UCSC Knowngenes, Ensembl等仔细挑选出33,045条lncRNA及30,215条mRNA,在待测肝癌及癌旁组织中逐一筛选；同时,启动子芯片对以上lncRNA启动子区域(转录起始位点-3500 bp到+1250 bp区域内)进行检测。为了避免技术变异性导致的数据误差,并精确评估样本间甲基化差异,lncRNA启动子芯片初步结果通过中位数对齐、分位数标准化和线性平滑等分析手段进行校正。为了进一步精确量化CpG甲基化水平,我们应用一种新的分析手段-MEDME (modeling experimental data with MeDIP enrichment)。MEDME利用绝对甲基化分数(absolute methylation score, AMS)筛选样本间lncRNA启动子差异性甲基化区域(differentially methylated region, DMR)。组间差异性甲基化测定通过AMS结果的t检验,P<0.05,AMS差值ABS (AMS_dif)大于8,定义为为候选DMR。然后再对候选DMR的AMS均值用t检验进行再次评估和检测,DMR内AMS的均值在两组间仍然具有显著差异则最终被选定。通过结合两种芯片的分析结果,挑选在肝癌及癌旁组织中表达水平存在差异表达,且启动子区域CpG岛高甲基化的肝癌特异性lncRNA。结果：LncRNA表达谱芯片结果显示,在肝癌组织和癌旁组织两组间差异倍数2倍以上,P<0.05,在16个样本中至少12个以上可以检测到的lncRNA共有2655个：其中在早期肝癌组织中表达上调的有1413个,表达水平下调的有1242个。LncRNA启动子芯片结果基于肝癌与癌旁组织中lncRNA启动子区域AMS的比较,启动子区域存在差异性甲基化的标准为：Probes in DMR≥2,ABS (AMS_dif)≥8,P<0.05。结果显示一共有1737个基因启动子区域甲基化水平存在显著差异。我们通过对lncRNA表达谱芯片和启动子芯片的检测结果进行联合分析,最终确定在早期肝癌中lncRNA启动子区域甲基化水平显著升高,而表达水平显著降低的lncRNA一共22个：SCARF1、AK126915、MST1P9、AK056817、SRD5A1P1、 RP1-93C23.1、HTR7P1、AK091100、RP11-755B10.3、AK127534、AC139666.1、 MTND4P25、MT1XP1、CTB-36O1.7、CTB-3601.6、AC115617.2、AY216265、 LOC113230、RP5-1154E9.6、MT-ATP8、AC013437.2及AC009960.8。结论：1ncRNA表达谱芯片是目前筛选肝癌相关lncRNA的常用手段,lncRN A启动子芯片能够灵敏高效的测定启动子区域的甲基化水平。通过结合两种芯片的优势,能够有效的筛选潜在的受启动子甲基化水平调控的肝癌特异性lncRNA,为之后进一步的验证奠定了基础。第二部分肝癌相关启动子高甲基化lncRNA的验证目的：LncRNA芯片的出现为肝癌相关lncRNA的筛选提供了高效的平台,具有全面覆盖、高效、高灵敏性等特点,但是由于芯片检测易受干扰,造成芯片结果不稳定。本部分研究旨在对前期筛选的22个候选IncRNA在肝癌、癌旁组织中的表达水平及启动子甲基化进一步验证,确定启动子甲基化调控的肝癌特异性lncRNA。方法：依据第一部分芯片筛选的结果,在选送芯片的8例肝癌患者肿瘤及癌旁组织中用Real-Time PCR的方法验证差异表达的lncRNA,并用甲基化特异性PCR反应(Methylation specific PCR, MSP)联合亚硫酸氢盐修饰结合测序法(Bisulphite modification combining sequencing PCR, BSP)验证其启动子甲基化状态。为了进一步核实候选IncRNA,剔除假阳性,我们设立另一个独立样本组,来自中山医院肝外科2009年的30例早期肝癌及癌旁标本,利用MSP验证候选lncRNA启动子甲基化水平；此外,我们在30例基础上增加24例早期肝癌样本利用Real-Time PCR扩大样本量验证候选IncRNA在肝癌和癌旁组织中的表达差异。结果：经过对选送芯片的8例早期肝癌患者的样本Real-Time PCR的验证,我们发现除lncRNA-SRD5A1PA (P=0.162)及lncRNA-RP1-93C23.1 (P=0.091)外,20个IncRNA在早期肝癌组织中均显著下调：AC115617.2(P=0.009),SCARF1(P=0.011), MST1P9 (P＜0.001), HTR7P1 (P=0.002), AK056817 (P=0.007), MTND4P25 (P=0.021), LOC113230(P=0.005), MT1XP1 (P<0.001), AC013437.2 (P=0.010), CTB-360.1.6 (P=0.009), CTB-360.1.7 (P=0.017), RP11-755B10.3 (P=0.007), AK127534 (P<0.001), AY216265 (P<0.001), AK091100 (P<0.001), RP5-1154E9.6(P<0.001), AC139666.1 (P=0.002), AK126915 (P=0.004), MT-ATP8 (P=0.020)及 AC009960.8 (P=0.035)。通过对候选的22个IncRNA启动子序列进行分析,存在CpG岛的共有13个,我们将这13个IncRNA进行BSP测序,结果显示,以上13个候选IncRNA在肝癌中启动子区域甲基化频率均大于40%,组间差异显著(P<0.01)。同时我们用MSP再次验证,结果与BSP相符。之后我们利用另外一组独立样本,分别用qPRC和MSP对候选IncRNA进行扩大样本量验证。在30例样本中,MSP验证的13个IncRNA在肝癌及癌旁组织中的甲基博士学位论文 启动子甲基化对长链非编码RNA在早期肝癌中的表达调控及功能研究化率分别为：SCARF1 (76.7% vs 26.7%), AK126915 (63.3% vs 20.0%), MSTIP9 (80% vs 40%), AK056817 (66.7% vs 30%), SRD5A1P1(RP1-93C23.1) (73.3% vs 43.3%), HTR7P1 (56.7% vs 16.7%), RP11-755B10.3 (63.3% vs 26.7%), AK127534 (53.3% vs 26.7%), CTB36O1.6-1.7 (83.3% vs 36.7%), AY216265 (70.0% vs 46.7%) and LOC113230 (60% vs 16.7%)。在30+24例早期肝癌及癌旁样本中,22个候选lncRNA在肝癌组织中全部显著降低：SCARF1, AK126915, LOCI 13230, MST1P9, AC009960.8, AK091100, MTND4P25, HTR7P1, MT1XP1, AC139666.1, RP11-755B10.3, AK127534, AK056817, AY216265, AC115617.2及AC013437.2 (P＜0.001); CTB-360.1.6(P=0.033); SRD5A1P1 (P=0.036); CTB-360.1.7 (P=0.046); RP5-1154E9.6(P=0.009); RP1-93C23.1 (P=0.022)。经过高通量芯片筛选和两次验证,我们结合芯片数据和验证结果在候选的22个IncRNA中挑选启动子DMR最显著的lncRNA-SCARF1(P=0.0004)进行后期的功能研究。结论：经过本部分两次验证表明,22个候选IncRNA在初步验证中有90.9%(20of22)在肝癌组织中表达下调；扩大样本量验证证实表达下调的IncRNA占100%(22 of 22)。而通过BSP、MSP两次验证的13个IncRNA,启动子区域在肝癌组织中均呈不同程度的高甲基化。由此可见,应用IncRNA表达谱芯片和启动子甲基化芯片筛选肝癌相关启动子高甲基化的IncRNA结果是稳定可靠的。博士学位论文启动子甲基化对长链非编码RNA在早期肝癌中的表达调控及功能研究第三部分 启动子甲基化对lncRNA-SCARF1在肝癌中的表达调控及功能研究目的：根据前期研究结果,我们发现lncRNA-SCARF1是一个启动子高度甲基化,在肝癌组织中表达水平显著下调的lncRN A,推测其可能在肝癌细胞中发挥抑癌作用。本部分研究旨在肝癌细胞株、肝癌及癌旁组织中进一步探讨启动子甲基化对lncRNA-SCA RF1的调控,初步了解lncRNA对肝癌的发生发展的影响、潜在通路及临床意义。方法：运用qRT-PCR检测lncRNA-SCARF1在肝癌细胞株HepG2、Huh7、 SMMC-7721、MHCC-97L、MHCC-97H、MHCC-LM3及正常肝细胞L02中的表达情况。通过甲基化抑制剂5-氮杂脱氧胞苷酸(5-aza-deoxycytidine,5’-Aza-dc)检测干预前后lncRNA-SCARF1表达水平的改变,同时采用BSP和MSP验证其启动子甲基化水平的改变。应用慢病毒转染技术过表达lncRNA-SCARF1,研究其对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭能力的影响；通过裸鼠皮下成瘤实验观察其对成瘤能力的作用。通过芯片预测以及最新的PCR基因信号通路芯片筛选lncRNA-SCARF1的潜在靶基因,并通过qRT-PCR和 Western Blot验证过表达肝癌细胞株潜在靶基因及相应蛋白水平的改变。结果：LncRNA-SCARF1在正常肝细胞株中的表达水平显著高于各个肝癌细胞株。通过在表达水平相对最低的HepG2和MHCC-97H中,用5’-Aza-dc干预后,BSP结果均确认lncRNA-SCARF1启动子甲基化水平显著下调；同时应用qRT-PCR检测发现lncRNA-SCARF1表达水平显著升高。通过慢病毒转染技术过表达转染HepG2及MHCC-97H后,能诱导肝癌细胞凋亡；而增殖、侵袭能力均明显下降。体内实验证实过表达lncRNA-SCARF1能明显抑制肝癌细胞在裸鼠皮下成瘤。根据lncRNA表达谱芯片结果建立的编码-非编码基因共表达网络分析发现lncRNA-SCARF1与16个编码基因呈正相关,与15个编码基因呈负相关。而基因集合富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)发现有3个与肿瘤相关的基因集以及1个细胞凋亡信号通路基因集与lncRNA-SCARF1呈正相关。在此基础上,我们应用肿瘤分子机制PCR芯片分别在MHCC-97H和HepG2中筛选下游靶基因,结果发现在lncRNA-SCARF1过表达的肝癌细胞中AKT1、PIK3CA、BCL2等7个基因明显下调,而BAX、BID、ELK1、PTEN中显著上调。结合芯片GSEA结果,我们用qRT-PCR和Western Blot分别在lncRNA-SCARF1过表达干预的97H及HepG2中验证,结果证实lncRNA-SCARF1表达水平的改变直接影响PIK3CA、AKT1、BAX和BCL-2在肝癌细胞中的表达。结论：在肝癌细胞中,lncRNA-SCARF1启动子甲基化是导致其表达沉默的重要原因；1ncRNA-SCARF1的激活能够显著抑制肝癌细胞的生长活性,促进肝癌细胞凋亡,抑制肝癌体内成瘤；其功能机制可能是通过PIK3CA/AKT通路实现对早期肝癌的抑制。