植物内生菌定居在健康植物组织内部,与宿主植物之间形成了一种互惠共生的关系,可以影响宿主植物的生长发育及其次级代谢产物的合成代谢,协调植物与环境的关系。而内生菌所在的宿主特殊环境,又使其可以产生新型活性次生代谢产物。近年来,内生菌及其代谢产物在医药、农林、环境等领域具有广泛的应用前景。黄花蒿(Artemisia annuaL.)是我国传统药用植物,已报道的内生菌资源丰富多样,具有巨大的开发潜力。本文针对一株有生物活性的黄花蒿内生草酸青霉菌(Penicillium oxalicum B4)在青蒿素生物合成调控、青蒿酸转化和三氯生的降解方面开展深入探讨,挖掘内生菌对青蒿素合成的调控机制,寻找新型有活性的青蒿酸衍生物,开拓内生菌在环境污染物的降解应用。主要结果如下:本文从野生黄花蒿中分离得到一株内生真菌B4,通过形态观察以及核糖体基因ITS序列分析,并构建系统发育树,发现该内生真菌与草酸青霉(P.oxalicum EU434727.1)等很多草酸青霉菌株的同源性达到99%。该序列已提交GenBank,登记号为FJ196840,定名为Penicillium oxalicum B4。通过对黄花嵩组培苗、种子萌发苗及不同培养体系的回接实验,确认P.oxalicum B4通过宿主根部侵染达到共生,并且定殖在根组织细胞间隙。B4抑制宿主地上部分的高度、侧根生长,对宿主生物量的影响不显著。B4对宿主生长素吲哚乙酸(IAA)的合成无影响,但对脱落酸(ABA)的合成影响较大,呈现先减小后增加的趋势。B4侵染可提高宿主体内青蒿酸、青蒿素的含量。在MS培养体系下,培养23 d后,B4侵染的组培苗中青蒿素的含量与对照组的相比提高了 42.86%。我们利用GC-TOF-MS分析了 B4侵染后黄花蒿代谢产物的变化。通过主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)等分析发现B4侵染后黄花蒿的代谢物发生了显著变化,有85个差异代谢物。其中阿魏酸和D-鞘氨醇的含量变化最大,分别增加了 266822倍和12324倍。差异化合物主要分布亮氨酸和异亮氨酸等氨基酸的合成及降解、嘌呤代谢、苯丙醇生物合成等24个代谢途径上。B4主要影响黄花蒿中缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢这三条途径。我们同时运用基因芯片技术分析了B4侵染23天后黄花蒿差异表达基因,B4侵染后,共有956个基因发生显著变化,其中有411个上调的和545个下调。通过GO分析发现B4影响黄花蒿蛋白质磷酸化、氧化还原反应、膜结构等相关基因表达。差异基因主要集中在植物病原相互作用、脂肪代谢、不饱和脂肪酸合成及萜类生物合成等生物学通路上。综合分析,我们发现B4通过诱导宿主代谢途径,改变了黄花蒿本身的代谢物合成趋向,促进防御性物质包括青蒿素的合成,为宿主及其自身的互利共生提供了条件。我们进一步研究了 B4对青蒿酸的生物转化。以青蒿酸为底物,在转化培养10天后,共得到21个转化产物,鉴定出8个化合物,其中3α,14-二羟基青蒿酸(th2-1)、3-羰基,14-羟基青蒿酸(th3)、3-羰基,15-羟基青蒿酸(th6)、15-羧基青蒿酸(th8)、15-羰基-1,2,3,6-脱氢青蒿酸(th7-2)为新化合物。3β,15-二羟基青蒿素酸(th5-2)、3-α羟基青蒿酸(th9)、9-氧代青蒿酸(th10)为已知化合物。青蒿酸及其衍生物具有抗肿瘤活性,尤其在HL60细胞系中,细胞毒活性比较:th7-2(IC50=8.32±0.19 μg/mL)>th3(IC50=8.69±0.15 μg/mL)>th2-1(IC50=9.63±0.55 μg/mL)>th6(IC50=11.24±1.01 μg/mL)>th8(IC50=14.00±0.46 μg/mL)>青蒿酸(IC50=15.04±1.48 μg/mL)。青蒿酸及其衍生物对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的抗炎活性显示,th9的活性最强,在5 μM剂量下,对NO产生的抑制率为42.83%。th6和th8在10 μM条件下,对NO产生的抑制率分别25.16%和43.91%。而青蒿酸以及其他衍生物对RAW264.7细胞NO的产生无抑制作用。本文还研究了 B4对具有环境毒害、难降解的抗生素—三氯生的生物降解。发现B4对三氯生有较大的吸附量,可达127.60±8.57 mg/g DW。在降解培养基中,添加三氯生后的前10分钟内,三氯生快速吸附到真菌菌丝体中。溶液中三氯生的浓度由5.00 mg/L降至0.41 mg/L。1小时内,菌丝体中三氯生含量由0.45降至0.05 mg/g DW。利用GC-MS对三氯生的降解产物进行分析,发现其降解产物中3种毒性化合物:2-氯对苯二酚、2,4-二氯酚和对苯二酚均被吸附在菌丝体中,培养液中没有检测到这3种化合物。大肠杆菌生长实验确认降解后的培养液无生长毒性。在人造废水体系(三氯生浓度为5 mg/L)中,B4可在2小时内完全降解了三氯生。综上所述,我们的研究为黄花蒿内生菌资源开发和利用提供了基础和参考。黄花蒿内生草酸青霉菌(P.oxalicum B4)具有促进宿主合成青蒿素的能力,为内生菌在黄花蒿栽培生产上的应用提供基础;我们首次报道了黄花蒿内生真菌B4可转化青蒿酸形成具有抗炎活性的新型衍生物,为内生菌利用青蒿酸发现更多先导化合物提供新途径;内生草酸青霉菌对三氯生具有高降解率、吸附量大和低毒性残留的新特点,为黄花蒿内生菌B4在废水和河流中三氯生生物修复中提供了新技术。