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【目的】
通过研究脐带间充质干细胞外泌体对阿霉素诱导心肌损伤的影响,进而探讨其对受损心肌是否具备修复作用。
【方法】
1.人脐带间充质干细胞的培养及外泌体的提取鉴定
使用人脐带间充质干细胞基础培养基培养细胞生长至70-80%融合度时,更换基础培养基为无外泌体血清培养基,继续培养72小时后收集细胞上清超速离心提取外泌体,并使用透射电子显微镜、纳米颗粒示踪、Western-blot蛋白印记等方法鉴定外泌体。
2.细胞分组
将细胞分为四组(1)空白对照组、(2)Dox组(Control组)、(3)H-Exo+Dox组、(4)L-Exo+Dox组;并根据实验要求予以不同剂量的脐带间充质干细胞外泌体及阿霉素共培养。
3.AnnexinⅤ-FIFC/PI检测心肌细胞凋亡
共培养24h后收集各组心肌细胞,用AnnexinⅤ-FIFC/PI凋亡检测试剂盒处理后于流式细胞机检测细胞凋亡率。
4.Western-blots蛋白印记检测各组心肌细胞的凋亡蛋白变化水平
共培养24h后收集各组心肌细胞并提取蛋白,分别检测Bax、Bcl-2、activeCaspase-3凋亡蛋白的表达差异。
【结果】
1.成功提取脐带间充质干细胞外泌体:体外培养的脐带间充质干细胞呈聚集性生长,长梭形态;超速离心法提取的外泌体在透射电子显微镜下呈圆形或茶托样或椭圆形囊泡状;纳米颗粒示踪检测外泌体平均粒径大小为136.1nm;Western-blot蛋白印记显示外泌体表面标记蛋白CD81、TSG101呈阳性表达。
2.AnnexinⅤ-FIFC/PI检测心肌细胞凋亡:与Dox组相比,L-Exo+Dox组细胞凋亡率(15.57±1.172)%较Dox组(27.00±1.900)%下降明显,差异有统计学意义(P<0.05);另外,予以更高浓度的脐带间充质干细胞外泌体处理后,H-Exo+Dox组细胞凋亡率(9.56%)较L-Exo+Dox组(15.57%)降低38.6%;两者差异有统计学意义(P<0.05),提示一定浓度的脐带间充质干细胞外泌体可减轻Dox对心肌的损害作用,并呈现出一定的剂量依赖性。
3.Western-blots蛋白印记检测各组心肌细胞的凋亡蛋白变化水平:Dox诱导心肌细胞凋亡后,Dox组的Bax及Caspase3表达量最高,Bcl-2表达量则最低,Bcl-2/Bax比值也处于最低水平;而予以外泌体干预后,L-Exo+Dox组Bax及Caspase3表达量较Dox组有下调,Bcl-2表达量则上升,Bcl-2/Bax比值也逐步上升;进一步予更高浓度的外泌体干预后,H-Exo+Dox组促凋亡蛋白则下降更加明显,而抑制凋亡蛋白Bcl-2则进一步上调,Bcl-2/Bax比值也随之上升;经统计学分析后,表明Bax、Caspase3、Bcl-2及Bcl-2/Bax比值在各组的表达存在差异,P<0.05,差异有统计学意义,提示一定浓度的脐带间充质干细胞外泌体可减轻Dox对心肌的损害作用,且一定范围内,随着外泌体的浓度的增加,其可进一步抑制Dox诱导的心肌凋亡。
【结论】
在阿霉素诱导心肌细胞凋亡的模型中,一定浓度的脐带间充质干细胞外泌体可减轻Dox对心肌的损害作用,且一定范围内,随着外泌体的浓度的增加,其可进一步抑制Dox诱导的心肌凋亡;其潜在的机制可能是通过Bcl-2/Bax细胞凋亡途径上调Bcl-2表达,下调Bax及activeCaspase-3表达,从而减轻心肌凋亡,发挥心肌保护作用。
通过研究脐带间充质干细胞外泌体对阿霉素诱导心肌损伤的影响,进而探讨其对受损心肌是否具备修复作用。
【方法】
1.人脐带间充质干细胞的培养及外泌体的提取鉴定
使用人脐带间充质干细胞基础培养基培养细胞生长至70-80%融合度时,更换基础培养基为无外泌体血清培养基,继续培养72小时后收集细胞上清超速离心提取外泌体,并使用透射电子显微镜、纳米颗粒示踪、Western-blot蛋白印记等方法鉴定外泌体。
2.细胞分组
将细胞分为四组(1)空白对照组、(2)Dox组(Control组)、(3)H-Exo+Dox组、(4)L-Exo+Dox组;并根据实验要求予以不同剂量的脐带间充质干细胞外泌体及阿霉素共培养。
3.AnnexinⅤ-FIFC/PI检测心肌细胞凋亡
共培养24h后收集各组心肌细胞,用AnnexinⅤ-FIFC/PI凋亡检测试剂盒处理后于流式细胞机检测细胞凋亡率。
4.Western-blots蛋白印记检测各组心肌细胞的凋亡蛋白变化水平
共培养24h后收集各组心肌细胞并提取蛋白,分别检测Bax、Bcl-2、activeCaspase-3凋亡蛋白的表达差异。
【结果】
1.成功提取脐带间充质干细胞外泌体:体外培养的脐带间充质干细胞呈聚集性生长,长梭形态;超速离心法提取的外泌体在透射电子显微镜下呈圆形或茶托样或椭圆形囊泡状;纳米颗粒示踪检测外泌体平均粒径大小为136.1nm;Western-blot蛋白印记显示外泌体表面标记蛋白CD81、TSG101呈阳性表达。
2.AnnexinⅤ-FIFC/PI检测心肌细胞凋亡:与Dox组相比,L-Exo+Dox组细胞凋亡率(15.57±1.172)%较Dox组(27.00±1.900)%下降明显,差异有统计学意义(P<0.05);另外,予以更高浓度的脐带间充质干细胞外泌体处理后,H-Exo+Dox组细胞凋亡率(9.56%)较L-Exo+Dox组(15.57%)降低38.6%;两者差异有统计学意义(P<0.05),提示一定浓度的脐带间充质干细胞外泌体可减轻Dox对心肌的损害作用,并呈现出一定的剂量依赖性。
3.Western-blots蛋白印记检测各组心肌细胞的凋亡蛋白变化水平:Dox诱导心肌细胞凋亡后,Dox组的Bax及Caspase3表达量最高,Bcl-2表达量则最低,Bcl-2/Bax比值也处于最低水平;而予以外泌体干预后,L-Exo+Dox组Bax及Caspase3表达量较Dox组有下调,Bcl-2表达量则上升,Bcl-2/Bax比值也逐步上升;进一步予更高浓度的外泌体干预后,H-Exo+Dox组促凋亡蛋白则下降更加明显,而抑制凋亡蛋白Bcl-2则进一步上调,Bcl-2/Bax比值也随之上升;经统计学分析后,表明Bax、Caspase3、Bcl-2及Bcl-2/Bax比值在各组的表达存在差异,P<0.05,差异有统计学意义,提示一定浓度的脐带间充质干细胞外泌体可减轻Dox对心肌的损害作用,且一定范围内,随着外泌体的浓度的增加,其可进一步抑制Dox诱导的心肌凋亡。
【结论】
在阿霉素诱导心肌细胞凋亡的模型中,一定浓度的脐带间充质干细胞外泌体可减轻Dox对心肌的损害作用,且一定范围内,随着外泌体的浓度的增加,其可进一步抑制Dox诱导的心肌凋亡;其潜在的机制可能是通过Bcl-2/Bax细胞凋亡途径上调Bcl-2表达,下调Bax及activeCaspase-3表达,从而减轻心肌凋亡,发挥心肌保护作用。