论文部分内容阅读
免疫球蛋白结合分子(Ig-binding proteins,IBP)是一类表达于细菌表面的能与宿主免疫球蛋白特定部位结合的蛋白,能调节宿主对细菌的免疫反应,是细菌重要致病因子之一。研究最多的IBP主要有3种:金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A,SpA)、链球菌(C和G群)蛋白G(Streptococcal protein G,SpG)和部分大消化链球菌表面的蛋白L(Peptostreptococcus magnus protein L,PpL)。这三种IBP分子的胞外部分均含由若干重复的序列高度同源的Ig结合结构域。在Ig结合特性上,这三种分子均具有各自的特点和局限。因此,通过对这三种分子进行重组,获得具有新的结合活性的重组IBP分子,已成为IBP研究的方向之一。在以前的研究中,我们将SpA和PpL的单个Ig结合结构域DNA片段随机拼接,再应用噬菌体展示技术将这些拼接后的分子表达于噬菌体表面,构建了SpA和PpL的单结构域随机组合分子噬菌体展示文库。以人Ig(包括IgG、IgA、IgM及IgE)为诱饵对文库进行亲和筛选,得到了一类筛选后文库中的优势克隆,即由PpL的B3结构域与SpA的D、A、B、C结构域(主要为D)间隔排列组成的新型进化IBP形式(MDPL-MDPA)n。由于VH3重链和κ轻链在IgG、IgA、IgM及IgE上均有分布,因此,我们推断,B3结构域和D结构域的间隔排列使该类分子具有对Ig的VH3重链和κ轻链的双位点结合,从而使亲和力明显提高而成为优势克隆。为验证我们提出的这一推断,本课题以LD3和LD5作为(MDPL-MDPA)n结构形式的代表分子,对LD3/5分子对各类Ig和Ig片断及scFv进行结合和竞争实验,同时比较LD3/5与SpA和PpL的差异,并应用SPR技术对LD3/5结合各类Ig的动力学和亲和性进行研究,证实了进化免疫球蛋白结合分子LD3/5具有对V_H3和V_κ的双位点协同结合特性。一、(MDPL-MDPA)n分子的结合特性的定性和定量研究本课题以LD3和LD5作为(MDPL-MDPA)n的代表性分子,首先对LD3/5进行原核表达和纯化。SpA和4L(由四个PpL的B3结构域组成)作为LD3/5的来源蛋白,用作结合特性的对照和竞争实验时的竞争物。人IgG以木瓜蛋白酶切获得Fab、Fc,对Fab、Fc及IgG、IgM、IgA及LD5蛋白进行生物素标记。三种scFv的表达质粒由荷兰Sanquil实验室Dr. Jan Voorberg提供,将质粒转化TG1进行诱导表达。以相同量的LD3、LD5、4L、SpA包板,用生物素标记的IgG、IgM、IgA及Fab、Fc分别进行结合ELISA。结果表明,对IgG的结合性,SpA>LD5≈LD3>4L;对Fc的结合性,SpA>LD5>LD3,4L不结合;而对IgM、IgA和Fab的结合性则呈现一致的趋势,即LD5>LD3>4L>SpA。由于IgM、IgA和Fab抗体结构的共同特点是都具有V_H3重链和κ轻链,而均没有可以与IBP分子结合的Fc段,因此可以看出,LD3/5相对于SpA和4L的结合优势表现在与含有VH3和Vκ位点的Fab的结合上,而对IgG-Fc的亲和性并无增高。这一结果支持我们的推断即LD3/5具有对Ig的VH3和Vκ的双位点结合特性,但由于以上的IgM、IgA和Fab均为血清多克隆组成,含有多种VH基因和轻链型别的组合,因此这一结果不能成为VH3和Vκ的双位点结合的直接证据。通过Western Blot和Dot Blot的方法对ELISA的结果进行了验证。在Western Blot中,以相同量的LD3、LD5、4L、SpA进行SDS-PAGE,转膜后与生物素标记的各种Ig结合,发现对LD3、LD5、4L、SpA对IgG、Fab、Fc的结合强弱关系与ELISA一致,而在对IgM、IgA的结合上,LD3/5的结合优势不明显,可能由于SDS-PAGE电泳过程和膜固相化改变了蛋白的构象,使LD3/5的结合特性受影响。在Dot Blot实验中,以相同量的LD3、LD5、4L、SpA及BSA点膜,与生物素标记的各种Ig结合。结果与Western Blot相似。基因工程scFv抗体具有单一的VH基因和轻链型别的组合,我们获得了三种scFv抗体,KM36 (VH3-Vλ3)、KM38 (VH3-VκⅠ)和KM41 (VH1-VκⅢ),用这三种scFv抗体包板,与生物素标记的LD5结合,结果显示LD5对这三种scFv的亲和性KM38>KM41>KM36。用这三种scFv抗体以生物素标记的LD5进行Western Blot检测,得到与ELISA同样的结果。该结果为LD3/5分子对VH3和Vκ双位点结合特性提供了直接证据。我们应用SPR技术对LD3、LD5、4L、SpA与Ig结合的动力学和亲和力进行了定量分析,测定了LD3/5及4L、SpA对各种Ig分子的结合率常数ka,解离率常数kd及平衡解离常数KD,本实验在复旦大学遗传所使用Biacore3000仪器进行。以IgG、IgM、IgA分别标记芯片,与LD3、LD5、4L、SpA分别结合,BIAevaluation 3.0软件分析结果,从得到的K_D看出,LD3/5对IgM和IgA的亲和性较4L高出1到8倍,较SpA则优势更明显。且对IgM比对IgA的结合优势更为明显,与ELISA结果一致。该结果对LD3/5的结合特性分析提供了定量的支持。二、LD3/5、4L、SpA结合各类Ig分子的竞争抑制实验结合实验的结果说明LD3/5分子与4L和SpA相比,具有对Ig-Fab的高亲和性。而这种现象可有两种解释,一是LD3/5对V_H3和V_κ两个位点结合的单纯相加效应,这种效应的结合应该能被4L和SpA的联合所有效的抑制;另一种解释,即本课题所提出的科学推断,LD3/5分子具有对V_H3和V_κ的双位点结合协同增强机制,从而使LD3/5对Ig-Fab的亲和性明显提高,而4L和SpA联合不能有效的抑制这种协同作用。因此,进行竞争性结合实验,是本课题验证LD3/5对VH3和Vκ双位点结合的关键所在。竞争抑制实验以两种方案进行,分别是以IBP分子包板和以Ig分子包板。在第一种方案中,以生物素标记的Ig和各种抑制蛋白(4L、LD3、LD5、SpA、4L+SpA)先作用,再移入4L、LD3、LD5、SpA包被条排孔反应;另一种方案则用Ig分子包板,同时加入生物素标记的LD5和各种抑制蛋白反应。这两种竞争实验的结果均表明,LD3/5能有效的抑制4L对IgM、IgA、IgG-Fab的结合和SpA对IgG和Fc的结合,LD3/5能100%的抑制自身对IgM、IgA、IgG-Fab的结合,而更为重要的是,4L和4L+SpA在与LD3/5相同的浓度下只能抑制50%-60%的LD3/5对IgM、IgA、IgG-Fab的结合,且继续升高4L和4L+SpA的浓度,抑制百分比无明显变化。这一结果有力的说明了LD3/5对IgM、IgA、IgG-Fab的V_H3和V_κ的双位点结合协同作用。在LD5结合scFv的竞争抑制实验中,虽然LD5对KM38的亲和性较KM36和KM41高,但LD5对KM38的结合却能有效地被4L及4L+SpA抑制。我们认为,由于基因工程scFv的VH和V_L区是以连接肽相连,其V_H-V_L异二聚体的构象与天然Ig不同,使LD3/5对VH3和V_κ的双位点结合不能有效实现。这也说明了双位点结合对抗体构象的严格要求。结论:本课题应用ELISA、Western Blot、Dot Blot和SPR等方法证实了新型进化免疫球蛋白结合分子LD3/5具有对IgG-Fab、IgM和IgA明显提高的亲和性,并且首次证实了由PpL的B3结构域和SpA的D结构域间隔重组的LD3/5分子具有对V_H3和V_κ的双位点协同结合特性。这类分子在免疫抗体检测方面具有应用前景,将提高对IgM、IgA的检测敏感性,有助于HIV、HCV等重大传染病的早期诊断,缩短检测“窗口期”及有效地防止输血后丙肝的发生。该研究也为体外分子进化技术改造天然免疫球蛋白结合分子获得新的结合功能提供一成功范例。