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FramePlot2.3.2分析结果显示吸水链霉菌10-22的一个基因组文库质粒pHZl392的36.7kb插入片段中共有29个开放阅读框(GenBank登录号为AY260760),其中含有一个由5个基因组成的基因簇.由于该基因簇与天蓝色链霉菌A3(2)的cvn11基因簇同源,故将其命名为cvh基因簇(cvh homolg of S.hygroscopicus 10-22).cch基因簇(cvhABCDE)的同源基因簇广泛存在于链霉菌中,天蓝色链霉菌A3(2)的基因组中有13个,阿维链霉菌MA4680的基因组中有11个.此外在该36.7kb插入片段中还有一个多药物抗性efflux蛋白编码基因,命名为hmr19.本文就cvh基因簇和hmr19基因的生物学特征进行了初步研究.
(1)cvh基因簇的第一个基因cvhA编码一个传感组氨酸蛋白激酶,因其N端有两个跨膜结构域,C端有一个保守的HATPase-c结构域.大肠杆菌表达的CvhA蛋白C端496个氨基酸多肽可实现体外自身磷酸化,且该磷酸基团具有酸敏感和碱稳定的特性,表明磷酸化位点为组氨酸.在添加了不同浓度葡萄糖或蔗糖的SFM(soya flour medium)固体培养基上,cvhA基因敲除菌株和野生型菌株10-22在气生菌丝和孢子形成方面基本没有差异,而在添加了6﹪和8﹪甘露醇、6﹪和8﹪山梨醇、4﹪和6﹪甘露糖、4﹪和6﹪果糖的SFM固体培养基上,cvhA基因敲除菌株所形成的气生菌丝和孢子比野生型菌株10-22所形成的气生菌丝和孢子要多得多,而且该表型可用单独的cvhA;基因实现遗传互补.在添加4﹪、6﹪和8﹪除蔗糖以外的碳源作为唯一碳源和以0.1﹪的(NH<,4>)<,2>SO<,4>作为唯一氮源的基本培养基中,cvhA基因敲除菌株的生长曲线和野生型菌株10-22的生长曲线基本一致.因此,我们认为CvhA是一个碳源依赖性的且对菌丝发育起负调控作用的传感组氨酸蛋白激酶.(2)保守结构域分析结果显示CvhD有一个Rab功能结构域,CvhE有一个CypX功能结构域.利用大肠杆菌表达系统分别表达了CvhD和CvhE蛋白,纯化的CvhD蛋白可将GTP水解成GDP,表明CvhD是一个小G蛋白.纯化的CvhE与CO结合后在450hm处呈现一个特异性的吸收峰,表明CvhE是一个细胞色素P450蛋白.利用基因同源重组技术分别构建了CvhB、C、D、E因敲除菌株并经Southern-blotting验证.在添加2﹪、4﹪、6﹪蔗糖的SFM固体培养基上,CvhB、C、D、E因敲除菌株与野生型菌株10-22相比在气生菌丝和孢子的形成方面都没有差异,而在添加2﹪、4﹪、6﹪甘露醇、山梨醇、甘露糖、果糖、葡萄糖的SFM固体培养基上,与野生型菌株10-22相比,CvhB、C、D、E因敲除菌株产生气生菌丝和孢子少且慢.生长测定结果显示在以2﹪、4﹪、6﹪除蔗糖以外的其它各糖作为唯一碳源和以0.1﹪的(NH<,4>)<,2>So<,4>作为唯一氮源的液体基本培养基中,CvhB、C、D、E硅因敲除菌株的生长曲线比较相似,且菌丝量都不同程度地低于野生型菌株10-22的菌丝量.RT-PCR结果显示cvhB、C、D、E转录,说明CvhBCDE是一个操纵子.至此,我们认为cvhBCDE是一个与菌丝发育有关的操纵子.
(3)BLAST分析、多序列比较、跨膜序列分析和保守motif分析结果显示hmr19基因编码一个属于MFS(major facilitator.superfamily,MFS)超家族中DHA2(drug:H<+> antiporter-2)家族的药物抗性efflux蛋白.利用大肠杆菌以融合蛋白的形式表达了Hmr19蛋白N端132个氨基酸,目标蛋白经纯化后免疫家兔,制备高免血清,并利用Western-blotting检测到10-22菌丝体中的Hmrl9蛋白.基于同源重组技术构建了hnu19基因敲除菌株EAK.生长抑制试验表明EAK对四环素、万古霉素和丝裂菌素C的敏感性要比野生型菌株10-22高5-20倍.四环素在EAK中的累积量明显高于10-22,但添加了能量抑制剂一氰氯苯腙后,四环素在EAK和10-22中的累积量则基本相同.据此可以确认Hmr19是一个多药物抗性efflux蛋白.