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研究背景血管内皮细胞活性与功能与心血管疾病有着密切关系,该细胞的衰老凋亡是心血管疾病发生发展的一个重要机制。血管内皮细胞的功能维持和新生血管生成是调节血管平衡、维持自身功能的关键,具有重要的维持内环境稳态、抗血栓、抗炎的作用,血管内皮细胞的再生、凋亡和衰老与动脉粥样硬化（AS）、急性心肌梗死（AMI）、高血压等疾病的发生发展有密切关系。深入了解内皮细胞凋亡衰老的分子作用机制,尤其是该细胞功能紊乱的分子机制和信号通路,能够有助于为血管疾病预防和治疗提供新的理论依据及临床治疗靶点。微小RNA（MicroRNA,miRNA）是基因调控功能的非编码区编码出来的单链RNA分子,这类miRNA长度约为二十二个核苷酸,在细胞质中成熟的miRNA能够与靶基因的信使RNA（messenger RNA,mRNA）3’非编码区（3’UTR）结合,从而影响靶基因mRNA的稳定性和目的蛋白质翻译,达到影响和调控目的基因表达水平。大量研究表明,在心血管疾病中,miRNA也参与了很多心血管事件的发生发展,主要是因为miRNA能够调控血管内皮细胞的增殖、趋化、迁移、抗凋亡等多项生理功能的mRNA,进而参与血管内皮功能修复、再内皮化及新生血管形成等,与多种血管性疾病的发生发展有着密切联系,进一步研究这类发病机制仍迫在眉睫。二型血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR-2）是大量表达在血管内皮细胞上,具有偶联丝氨酸/酪氨酸激酶活性,能够活化下游多种信号通路,控制内皮细胞多方面的功能,影响内皮细胞增殖、抗凋亡、趋化、迁移、抗血栓、再血管化、加速新生血管形成、促进损伤组织修复等。目的本研究旨在结合已发表论文和现有生物信息学预测大数据库（Target scan、miRANDA、miRDB）,发现能够与VEGFR-2的mRNA中3’UTR序列结合的miRNAs,并探讨miRNAs对VEGFR-2的干扰,从中选出与VEGFR-2结合最佳的miRNA,并进一步分析调控VEGFR-2信号通路来探讨miRNA对血管内皮细胞迁移、增殖、凋亡等功能的影响。方法1预测和验证VEGFR-2基因的调控miRNAs结合前期的急性心肌梗死患者（AMI）循环血液miRNAs芯片基因检测数据和数据库Target-Scan（http://www.targetscan.org/）、MiRNAs（http://mirdb.org）、miRBase、Miranda等miRNA-生物信息学大数据库的研究,我们发现Hsa-miR-15b-5p、Hsa-miR-15a-5p、HsamiR-497-5p在AMI患者循环血液中大量存在,但其功能有待于进一步探究。三种miRNAs均通过荧光报告实验来验证与VEGFR-2靶基因mRNA的3’UTR序列结合。2合成3种目标miRNA类似物及miRNA抑制剂三种目标miRNA类似物、单链抑制剂以及阴性对照的miRNA序列见下:hsa-miR-15b-5p MIMAT0000417序列（5’-3’）UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA hsa-miR-15b-5p inhibitors序列（5’-3’）UGUAAACCAUGAUGUGCUGCUA hsa-miR-15a-5p MIMAU0000068序列（5’-3’）UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG hsa-miR-15a-5p inhibitors序列（5’-3’）CACAAACCAUUAUGUGCUGCUA hsa-miR-497-5p MIMAU0002820序列（5’-3’）CAGCAGCACACUGUGGUUUGU hsa-miR-497-5p inhibitors序列（5’-3’）ACAAACCACAGUGUGCUGCUG MiRNA Negative control序列（5’-3’）UUCUCCGAACGUGUCACGU antisense（5’-3’）ACGUGACACGUUCGGAGAA3建立HUVECs及细胞转染实验在细胞培养室全程无菌操作,用胰酶EDTA消化获得脐静脉内皮细胞（HUVECs）,将原代HUVECs培养在无血清内皮细胞专用Endothelial-SFM培养基中,而且添加必要的生长因子和抗生素。所有的细胞都培养在细胞培养箱,5%CO2、37℃饱和湿度。当细胞传代在2-7代、达到80%融合时进行各项试验。miRNA类似物和抑制剂利用脂质体转染到HUVECs细胞。所有试验分为3组:分别为阴性对照组、miRNA组、miRNA+miRNA抑制剂组。4内皮细胞形态学、功能学及分子生物实验（1）HUVECs的MTT增殖率检测;（2）流式细胞术Annexin V/7-AAD检测细胞凋亡;（3）HUVECs划痕实验;（4）HUVECs血管形成能力;（5）荧光定量qPCR检测各组间HUVECs细胞VEGFR-2、Bcl2及AKT mRNA表达情况;（6）Western bloting蛋白印迹法检测各组HUVECs细胞中,目标蛋白如VEGFR-2及磷酸化-AKT、活化Caspase3、Bcl2表达情况。结果1.荧光报告实验表明,3种预测的miRNAs中,仅miR-15b-5p具有结合活性,并能够影响VEGFR-2的mRNA稳定性;2.MTT法测定miR-15b-5p对内皮细胞增殖的影响,发现该miRNA能够抑制HUVECs增殖;3.Annexin V/7-AAD法流式细胞检测HUVECs凋亡,发现过表达miR-15b-5p后,HUVECs凋亡显著增加;4.MiR-15b-5p抑制HUVECs的血管生成和迁移能力;5.MiR-15b-5p可通过影响HUVECs的VEGFR-2 mRNA及蛋白水平的表达,从而调控AKT mRNA和蛋白水平的表达,而miR-15b-5p抑制剂可特异性的抑制这一过程;6.转染miR-15b-5p类似物的HUVECs培养48 h后,发现活化的Caspase3蛋白表达水平上调,同时Bcl2在mRNA水平和蛋白水平均显著降低。结论1.MiR-15b-5p能靶向结合VEGFR-2 mRNA,从而抑制HUVECs增殖及迁移能力,促进细胞凋亡,从而阻碍内皮细胞血管生成。2.MiR-15b-5p可通过调控VEGFR-2、AKT、Caspase3、Bcl2等分子mRNA和蛋白分子表达水平来调节和影响HUVECs各种生物学功能。3.MiR-15b-5p单链抑制剂能够抑制miR-15b-5p的负性调控作用,有希望成为一种治疗miR-15b-5p过表达引起血管内皮细胞损伤的药物。