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目的:根据全球及我国癌症中心权威数据，无论在全球还是我国，肺癌的发病率及死亡率多年来均居首位。肿瘤细胞的侵袭、转移是恶性肿瘤的主要特征，结肺癌脑、骨等转移在临床极为常见，也是导致患者死亡的主要原因。因为大部分肺癌症状比较隐匿，自身难以察觉，患者在发现时已失去手术根治的机会，所以深入的研究肺癌侵袭转移及放疗增敏的可能机制，掌握其中的关键靶点，对提高肺癌患者的放疗疗效以及改善患者预后有重要意义。丝状伪足是富含肌动蛋白的突起状结构，是细胞对外界环境的感受器，多项研究表明，丝状伪足在恶性肿瘤转移的起始阶段、中间阶段，及远处靶器官定居的终末阶段均发挥关键作用。肌球蛋白X(MyosinX，Myo10)是我们前期研究中发现的、一种定位在丝状伪足尖端的非传统肌球蛋白，可通过促进丝状伪足的生长和延伸，来增强肿瘤细胞的迁移能力及侵袭力。本研究运用CRISPR/Cas9技术敲除MyosinX，通过细胞学实验、动物皮下成瘤及测定细胞放射敏感性等相关实验，以观察其对非小细胞肺癌H1975细胞系增殖、迁移、放射敏感性的影响及其可能机制，以期发现MyosinX在肺癌形成、侵袭转移及放射敏感性中的作用及其临床意义。
方法：
1、采用TCGA可视化网站GEPIA对肺癌中包括MyosinX在内的常见分子靶点进行多基因表达比较，并运用免疫组织化学技术对肺腺癌和肺鳞癌患者肿瘤组织切片MyosinX进行染色，以了解MyosinX在肺癌组织中的表达状态。利用Westernblotting方法测定四种常见的非小细胞肺癌细胞系H1975、A549、292H、H1299中MyosinX的相对表达量。
2、本课题组前期已经成功构设计出能够敲除MyosinX的sgRNA序列并将其与含Cas9蛋白的载体lenti-CRISPRV2成功连接后制成慢病毒，现用慢病毒感染H1975非小细胞肺癌细胞系，经有限稀释法后进行单克隆筛选，利用Westernblotting方法验证单克隆细胞株MyosinX蛋白的表达情况并建立对照细胞系。
3、利用已成功建立的H1975-MyosinX敲除组及H1975-MyosinX对照组稳定细胞系，CCK8细胞增殖实验比较MyosinX敲除前后细胞增殖活力变化；平板克隆形成实验检测两组细胞克隆形成能力变化；流式细胞仪检测细胞周期变化；免疫荧光染色比较敲除前后MyosinX表达变化；而为了对比两组细胞的迁移能力是否产生改变，我们进行了Transwell小室实验以及划痕愈合实验；进行MyosinX调控肺癌细胞相关生物学行为的实验。
4、接种H1975-对照组细胞和H1975-敲除组细胞以1×107个/只分别接种到Balb/cnu裸鼠右后肢外侧皮下(n=3)构建裸鼠皮下移植瘤模型，比较两组移植瘤形成能力的差异，取小鼠肿瘤组织切片进行Ki-67免疫组化染色以比较两组增殖速度。
5、克隆形成实验及多靶单击模型拟合存活曲线，计算检测两组细胞D0、Dq及SER值以比较其对射线敏感性的差异。γ-H2AX焦点形成实验及RNAseq差异分析技术寻找可能参与MyonsinX介导的非小细胞肺癌放射敏感性调节机制。
结果：
1、使用GEPIA网站进行多基因表达比较，在肺腺癌与肺鳞癌中，EGFR基因相对表达量为4及4.9，而MyosinX的相对表达量为4和4.3；从肺腺癌与肺鳞癌患者肿瘤组织切片的HE染色和MyosinX免疫组化图中我们可以看出，MyosinX蛋白阳性表达细胞数>50%，表达量相对较高；MyosinX在H1975细胞中表达量明显高于其他细胞系。
2、经鉴定成功构建了MyosinXsgRNA-Lenti-CRISPRV2慢病毒载体，嘌呤霉素筛选后免疫荧光及westernblotting检测敲除效率经得到MyosinX完全敲除的H1975(KO组)及对照组(NC组)稳定细胞株。
3、CCK-8结果显示H1975-KO细胞增殖活力下降，流式细胞术发现敲除MyosinX后细胞周期发生改变,平板克隆形成实验提示敲除MyosinX后形成克隆数减少、克隆变小；敲除MyosinX后H1975细胞迁移能力发生改变，细胞划痕实验、Transwell迁移实验显示敲除MyosinX后细胞迁移能力下降。
4、成功构建了H1975细胞裸鼠皮下移植瘤模型，细胞接种5天后，在细胞注射部位有类似包块状突起形成，H1975-NC组形成的肿瘤体积为15.91±4.35mm3,H1975-KO组形成的肿瘤体积3.623±1.66mm3。之后隔天测量，12天后处死裸鼠，H1975-NC组形成的肿瘤体积为233±87.69mm3，H1975-KO组形成的肿瘤体积为65.67±24.07mm3，经One-wayANONA统计分析差异具有显著性，敲除MyosinX后其肿瘤生长速率降低。
5、克隆形成实验及细胞存活曲线证明相较于NC组细胞，KO组对射线的敏感性更强，D0值从1.24Gy下降至1.03Gy，SF2从0.29下降至0.21；SER值为1.21；γ-H2AX焦点形成实验显示在辐照后1h和6h，KO组形成的损伤焦点数均多于KO组。RNAseq差异分析技术及蛋白印迹技术显示：KO组ISLR蛋白(Immunoglobulinsuperfamilycontainingleucine-richrepeat，富含亮氨酸重复序列的免疫球蛋白样蛋白)明显低于NC组。
结论：体内及体外实验均表明MyosinX参与肺癌的增殖、侵袭、转移，MyosinX的敲除显著降低了H1975细胞增殖活力、细胞迁移能力。MyosinX的敲除可能通过影响细胞有丝分裂、降低与侵袭迁移相关基因表达水平等途径降低肺癌增殖和侵袭迁移能力。敲除MyosinX可以增强非小细胞肺癌H1975细胞的放射敏感性，其机制可能与干扰DNA双链损伤修复以及降低ISLR的表达有关。
方法：
1、采用TCGA可视化网站GEPIA对肺癌中包括MyosinX在内的常见分子靶点进行多基因表达比较，并运用免疫组织化学技术对肺腺癌和肺鳞癌患者肿瘤组织切片MyosinX进行染色，以了解MyosinX在肺癌组织中的表达状态。利用Westernblotting方法测定四种常见的非小细胞肺癌细胞系H1975、A549、292H、H1299中MyosinX的相对表达量。
2、本课题组前期已经成功构设计出能够敲除MyosinX的sgRNA序列并将其与含Cas9蛋白的载体lenti-CRISPRV2成功连接后制成慢病毒，现用慢病毒感染H1975非小细胞肺癌细胞系，经有限稀释法后进行单克隆筛选，利用Westernblotting方法验证单克隆细胞株MyosinX蛋白的表达情况并建立对照细胞系。
3、利用已成功建立的H1975-MyosinX敲除组及H1975-MyosinX对照组稳定细胞系，CCK8细胞增殖实验比较MyosinX敲除前后细胞增殖活力变化；平板克隆形成实验检测两组细胞克隆形成能力变化；流式细胞仪检测细胞周期变化；免疫荧光染色比较敲除前后MyosinX表达变化；而为了对比两组细胞的迁移能力是否产生改变，我们进行了Transwell小室实验以及划痕愈合实验；进行MyosinX调控肺癌细胞相关生物学行为的实验。
4、接种H1975-对照组细胞和H1975-敲除组细胞以1×107个/只分别接种到Balb/cnu裸鼠右后肢外侧皮下(n=3)构建裸鼠皮下移植瘤模型，比较两组移植瘤形成能力的差异，取小鼠肿瘤组织切片进行Ki-67免疫组化染色以比较两组增殖速度。
5、克隆形成实验及多靶单击模型拟合存活曲线，计算检测两组细胞D0、Dq及SER值以比较其对射线敏感性的差异。γ-H2AX焦点形成实验及RNAseq差异分析技术寻找可能参与MyonsinX介导的非小细胞肺癌放射敏感性调节机制。
结果：
1、使用GEPIA网站进行多基因表达比较，在肺腺癌与肺鳞癌中，EGFR基因相对表达量为4及4.9，而MyosinX的相对表达量为4和4.3；从肺腺癌与肺鳞癌患者肿瘤组织切片的HE染色和MyosinX免疫组化图中我们可以看出，MyosinX蛋白阳性表达细胞数>50%，表达量相对较高；MyosinX在H1975细胞中表达量明显高于其他细胞系。
2、经鉴定成功构建了MyosinXsgRNA-Lenti-CRISPRV2慢病毒载体，嘌呤霉素筛选后免疫荧光及westernblotting检测敲除效率经得到MyosinX完全敲除的H1975(KO组)及对照组(NC组)稳定细胞株。
3、CCK-8结果显示H1975-KO细胞增殖活力下降，流式细胞术发现敲除MyosinX后细胞周期发生改变,平板克隆形成实验提示敲除MyosinX后形成克隆数减少、克隆变小；敲除MyosinX后H1975细胞迁移能力发生改变，细胞划痕实验、Transwell迁移实验显示敲除MyosinX后细胞迁移能力下降。
4、成功构建了H1975细胞裸鼠皮下移植瘤模型，细胞接种5天后，在细胞注射部位有类似包块状突起形成，H1975-NC组形成的肿瘤体积为15.91±4.35mm3,H1975-KO组形成的肿瘤体积3.623±1.66mm3。之后隔天测量，12天后处死裸鼠，H1975-NC组形成的肿瘤体积为233±87.69mm3，H1975-KO组形成的肿瘤体积为65.67±24.07mm3，经One-wayANONA统计分析差异具有显著性，敲除MyosinX后其肿瘤生长速率降低。
5、克隆形成实验及细胞存活曲线证明相较于NC组细胞，KO组对射线的敏感性更强，D0值从1.24Gy下降至1.03Gy，SF2从0.29下降至0.21；SER值为1.21；γ-H2AX焦点形成实验显示在辐照后1h和6h，KO组形成的损伤焦点数均多于KO组。RNAseq差异分析技术及蛋白印迹技术显示：KO组ISLR蛋白(Immunoglobulinsuperfamilycontainingleucine-richrepeat，富含亮氨酸重复序列的免疫球蛋白样蛋白)明显低于NC组。
结论：体内及体外实验均表明MyosinX参与肺癌的增殖、侵袭、转移，MyosinX的敲除显著降低了H1975细胞增殖活力、细胞迁移能力。MyosinX的敲除可能通过影响细胞有丝分裂、降低与侵袭迁移相关基因表达水平等途径降低肺癌增殖和侵袭迁移能力。敲除MyosinX可以增强非小细胞肺癌H1975细胞的放射敏感性，其机制可能与干扰DNA双链损伤修复以及降低ISLR的表达有关。