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研究背景宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤之一。随着人们性观念及性行为的改变,我国宫颈癌的发病呈现年轻化的趋势。尽管宫颈癌筛查项目在不断普及,每年仍有大量宫颈癌新发病例及死亡病例。现已明确,高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是宫颈癌发生的主要原因,但是我国大陆尚未批准HPV疫苗用于预防宫颈癌。即使批准HPV疫苗上市,通过大规模接种HPV疫苗以有效减低宫颈癌的发病率,估计需要至少20年的时间；而在这段时间内会有新的高危型HPV感染者和宫颈癌新发患者。由于宫颈癌年轻化的趋势以及我国女性生育年龄的推迟,越来越多的女性在未完成生育之前罹患宫颈癌,因此要求保留生育功能的宫颈癌患者数量逐渐增多。目前保留生育功能的治疗方式主要是手术,而手术可引起宫颈管狭窄、孕期流产或早产等并发症。另外,尽管大部分宫颈癌患者诊断时多为早期,但每年仍有大量患者被诊断为晚期宫颈癌,且部分对放化疗不敏感。宫颈癌组织侵袭宫旁组织及出现宫旁浸润甚至远处转移,是宫颈癌治疗失败的原因。因此,需要新的思路和方法治疗宫颈癌。微小RNA (microRNA, miRNA)是一类长约20个核苷酸的非编码RNA,可通过与靶基因的3’端非翻译区结合,引起mRNA的降解或抑制蛋白翻译。多种miRNA可调控人体的基因表达,参与肿瘤的发生发展及转移。研究发现,miRNA-146不仅与炎症及免疫疾病密切相关,还与多种肿瘤如前列腺癌、肺癌的发生密切相关。其中,miRNA-146a和miRNA-146b是高度同源的miRNA,属于miRNA-146家族。MiR-146b-5p是从miRNA-146b前体的5’端臂加工而来的。在多种恶性肿瘤中miR-146b-5p的表达异常下调,miR-146b-5p的过表达可抑制肿瘤的生长、侵袭及转移,提示miR-146b-5p是一种抑癌基因。有研究表明,宫颈癌细胞系CaSki转染miR-146a后,可以促进细胞的生长,提示miR-146a是一种癌基因。而目前miR-146b-5p在宫颈癌细胞中的作用尚不清楚。因此本课题旨在探讨miRNA-146b-5p对宫颈癌细胞的增殖、细胞周期、侵袭能力、端粒酶活性及分泌细胞因子等生物学行为的影响,并初步探讨其作用机制,为宫颈癌的靶向治疗提供思路和实验室依据。第一部分：MiR-146b-5p对人宫颈癌细胞系Caski生物学行为的影响目的：探讨过表达miRNA-146b-5p对宫颈癌细胞系Caski增殖、细胞周期、侵袭、粘附、端粒酶活性及分泌细胞因子等生物学行为的影响。方法：(1)筛选并验证稳定表达miRNA-146b-5p的细胞：应用脂质体将pGPU6/Neo-miR-146b-5p重组质粒转染至Caski细胞后用G418进行筛选,实时定量PCR检测转染组细胞miRNA-146b-5p的相对表达量。(2)MTS法检测miR-146b-5p对细胞增殖活力的影响。(3)Transwell侵袭实验检测miR-146b-5p对细胞侵袭能力的影响。(4)细胞粘附实验检测miR-146b-5p对细胞粘附能力的影响。(5)流式细胞术检测miR-146b-5p对细胞周期的影响。(6)ELISA法检测miR-146b-5p对细胞因子TGF-β1、MCP-1、TNF-α分泌的影响。(7)TRAP-PCR-ELISA法检测miR-146b-5p对细胞端粒酶活性的影响。结果：(1)筛选出稳定表达miR-146b-5p的Caski细胞,miR-146b-5p转染组Caski细胞miR-146b-5p的表达量显著升高。(2)过表达miR-146b-5p抑制Caski细胞的增殖活力。(3)过表达miR-146b-5p降低Caski细胞的侵袭能力。(4)过表达miR-146b-5p降低Caski细胞的粘附能力。(5)过表达miR-146b-5p增加Caski细胞周期中G0/G1细胞的比例。(6)过表达miR-146b-5p抑制细胞因子TGF-β1、MCP-1、TNF-α的分泌。(7)过表达miR-146b-5p降低Caski细胞端粒酶的活性。结论：miR-146b-5p可以抑制宫颈癌细胞Caski的增殖、侵袭和粘附能力,使细胞周期阻滞于G0/G1,还抑制细胞因子TGF-β、MCP-1和TNF-α的分泌,并抑制端粒酶活性,从而抑制宫颈癌细胞的生长。第二部分：MiR-146b-5p影响人宫颈癌细胞系Caski生物学行为的机制研究目的：过表达miR-146b-5p对Caski细胞CXCR4、MMP-2、MMP-9、c-Myc、 cyclin D1、p27、p53、HPV16 E6表达的影响,对信号通路关键分子JNK、Akt磷酸化水平及NF-κB/STAT转录信号通路的影响,初步探索miR-146b-5p影响Caski细胞生物学行为的作用机制。方法：(1)Real-time PCR和Western blot法检测细胞中CXCR4、MMP-2、MMP-9、c-Myc、cyclin D1、p27、p53及HPV16 E6在mRNA和蛋白的表达水平。(2)Western blot法检测磷酸化JNK和Akt蛋白的表达。(3)双荧光素酶报告基因分析NF-κB、STAT3及STAT5的转录活性。结果：(1)过表达miR-146b-5p下调Caski细胞CXCR4、MMP-2、MMP-9、c-Myc、cyclinDl和HPV16 E6的mRNA和蛋白的表达,上调p27和p53的mRNA和蛋白的表达。(2)过表达miR-146b-5p降低Caski细胞JNK、Akt磷酸化水平。(3)过表达miR-146b-5p降低Caski细胞NF-κB、STAT3及STAT5的转录活性。结论：过表达miR-146b-5p通过JNK, Akt及NF-κB/STAT转录信号通路,下调CXCR4、MMP-2、MMP-9、c-Myc、cyclinD1和HPV16 E6的表达,上调p27和p53的表达,影响Caski细胞增殖、周期、侵袭、粘附及端粒酶活性等生物学行为。