研究背景:乳腺癌是妇科常见的肿瘤,已成为威胁妇女健康最大的疾病。根据2014年的美国癌症病人的死亡人数以及发病率的统计,在女性人群中最为常见的癌症为乳腺癌、肺癌和结肠癌,其中最高的发病率为乳腺癌,达到29%;其死亡率为15%,占到了第二位。顺铂(Cisplatin)是第一代铂类药物,也是一种细胞周期非特异性药物。顺铂的主要作用靶点是细胞内具有亲核性的DNA、蛋白质以及RNA。目前顺铂是临床治疗肿瘤的一种广谱抗癌药物,是广泛应用于治疗实体肿瘤的抗癌药物之一,如乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌和肺癌等的治疗。但病人在治疗过程中常会出现一些抵抗现象,具体的原因不清。其中DNA修复功能的增强,抵消顺铂对DNA修复效应的抑制作用是顺铂抵抗最重要的机制之一。有效的DNA损伤修复部分取决于结构特定的核酸酶家族成员移除损坏的基团或核苷酸和各种DNA中间结构。而FEN1(flap endonuclease 1,瓣状核酸内切酶)是DNA修复家族中的重要成员,在DNA的复制和修复中发挥着关键的作用。在胃癌SGC?7901细胞中,下调FEN1的表达可以增加顺铂治疗的敏感性。同时,在乳腺癌细胞中FEN1是高度表达的,FEN1的过表达可能与乳腺癌的多药耐药有关。但是FEN1在顺铂抵抗中的具体作用和机制并不清楚。姜黄素(Curcumin)从姜黄的根茎中提取的一种多酚类活性物质,具有明显的清除自由基、抗氧化、抗癌和抑制脂质过氧化功能。同时姜黄素还可以作为肿瘤化疗增敏剂诱导乳腺癌细胞的凋亡,并且能够使肿瘤在体外和体内的生长受到抑制。我们前期的工作发现姜黄素可下调FEN1的表达抑制乳腺癌细胞的增殖。以此推测,姜黄素可能通过下调FEN1的表达,增强顺铂的敏感性。为此,我们采用了MCF-7、MCF-7DDP(MCF-7顺铂抵抗细胞)、MDA-MB-231乳腺癌细胞和裸鼠移植瘤模型对FEN1在乳腺癌顺铂抵抗和姜黄素增敏效应中的作用及其机制进行了研究。研究内容:第一部分FEN1在乳腺癌顺铂治疗敏感性中的作用研究1.顺铂对乳腺癌细胞增殖的影响。2.顺铂对乳腺癌细胞中fen1表达的影响。3.mcf-7和mcf-7ddp细胞表型及其fen1表达差异的鉴定。4.fen1过表达对mcf-7细胞顺铂敏感性的影响。5.干扰fen1表达后,mcf-7ddp细胞对顺铂敏感的改变。第二部分姜黄素通过下调fen1表达增敏乳腺癌细胞顺铂治疗敏感性的研究1.姜黄素对乳腺癌细胞中fen1表达以及细胞增殖的影响。2.顺铂联合姜黄素对乳腺癌细胞的增殖和凋亡以及fen1表达的影响。3.顺铂联合姜黄素对裸鼠肿瘤成瘤及fen1表达的影响。第三部分姜黄素下调fen1表达的分子机制研究1.顺铂、erk抑制剂u0126单独或联合处理mcf-7和mcf-7ddp细胞后,erk磷酸化和fen1表达水平的改变。2.顺铂和姜黄素单独以及联合处理mcf-7和mcf-7ddp细胞后,erk磷酸化和fen1表达水平的改变。3.顺铂和姜黄素单独以及联合作用mcf-7和mda-mb-231细胞后,fen1基因表达调节层次的研究。4.顺铂联合姜黄素以及蛋白酶抑制剂mg132处理mda-mb-231细胞后,fen1泛素化和表达的改变。研究结果:(一)fen1在乳腺癌顺铂治疗敏感性中的作用研究1.低浓度顺铂对乳腺癌细胞的增殖无影响;高浓度的顺铂以剂量依赖方式抑制乳腺癌细胞的增殖。2.顺铂增殖抑制无效浓度或者顺铂低浓度处理乳腺癌细胞时,fen1蛋白表达随顺铂处理剂量依赖性的上调。3.mcf-7ddp细胞中fen1的表达明显高于mcf-7细胞。4.fen1的过表达降低mcf-7细胞对顺铂的敏感性。5.沉默mcf-7ddp细胞中fen1的表达,mcf7-ddp细胞恢复对顺铂的敏感性。(二)姜黄素通过下调fen1表达增敏乳腺癌顺铂治疗敏感性的研究1.姜黄素可以通过下调乳腺癌细胞中fen1的表达,抑制细胞的增殖。2.顺铂联合姜黄素可以通过下调fen1表达,抑制乳腺癌细胞的增殖和促进其凋亡,增强乳腺癌细胞对顺铂的敏感性。3.裸鼠肿瘤移植实验证实顺铂联合姜黄素可抑制肿瘤生长以及下调FEN1的表达。(三)姜黄素下调FEN1的分子机制研究1.MCF-7和MCF-7DDP细胞中姜黄素下调FEN1的表达增强顺铂的敏感性涉及ERK磷酸化的抑制。2.MDA-MB-231细胞中姜黄素下调FEN1的表达增强顺铂的敏感性涉及FEN1泛素化的增强。结论:FEN1的过表达参与了乳腺癌细胞顺铂耐药,姜黄素可通过下调FEN1表达来增强乳腺癌细胞对于顺铂治疗的敏感性,而该效应是通过姜黄素降低ERK的磷酸化或增强FEN1的泛素化从而下调FEN1的表达实现的。研究意义:我们目前的研究证实FEN1过表达在乳腺癌细胞顺铂治疗抵抗中发挥了非常重要的作用,它是姜黄素增敏顺铂治疗敏感性的一个新靶点。该研究的结果为乳腺癌细胞顺铂耐药提供了一个新的机制,也为姜黄素在乳腺癌细胞中作为顺铂增敏剂提供了一个新机制。同时,由于设法降低FEN1的表达可增强乳腺癌细胞顺铂的敏感性,这为临床寻找增强乳腺癌顺铂化疗敏感性的新措施奠定了理论基础。