龟板防治GIOP中miRNA调控Wnt/β-catenin通路的机理研究

来源 :广州中医药大学 | 被引量 : 10次 | 上传用户:congmingwangzi
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目的:1.筛查GIOP患者椎体骨组织中差异表达的miRNA并通过生物信息学分析预测Wnt/β-catenin通路相关的靶基因,初步揭示GIOP的发病机制;2.明确补肾中药龟板在体内防治GIOP的作用并探讨差异miRNA let-7f调控wnt/β-catenin信号通路在补肾中药龟板防治GIOP过程的作用;3.探讨补肾中药龟板有效成分促进BMSCs增殖和成骨分化的作用及let-7f对TNFR2的靶向调控作用。方法:1.临床研究(1)高通量测序筛查差异miRNA及其靶基因预测选取2014年10月-2015年10月广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科入院需要行脊柱手术治疗的患者6例,其中GIOP患者3例,正常对照组3例。收集其椎体骨进行总RNA提取,高通量测序筛查椎体骨组织中差异miRNA;生物信息学对差异miRNAs进行聚类分析,预测差异miRNA靶基因,并进行GO分析、Pathway分析和新miRNAs预测。(2)RT-qPCR验证高通量测序筛查的差异miRNAs,预测Wnt/β-catenin通路相关的靶基因选取2014年10月-2016年10月广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科收入院需要行脊柱手术治疗的患者20例,其中GIOP10例,正常对照组10例。RT-qPCR验证高通量测序筛查的差异miRNAs,生物信息学分析预测验证后差异miRNA靶基因,并预测与Wnt/β-catenin通路相关的靶基因。2.动物实验研究(1)龟板对GIOP大鼠的防治作用200只3月龄SD大鼠随机分为两部分,每部分100只,分别用于预防实验和治疗实验的研究。预防实验和治疗实验均随机分为五个组,每组20只,两部分实验分组均为:对照组(SHAM组)、模型组(GIOP组)、阿伦磷酸钠组(ALN组)、龟板组(PT组),龟板+阿伦磷酸钠联合组(PT+ALN组)。预防实验在造模的同时给予药物干预,分别在造模或给药后1月(M1)、2月(M2)和3月(M3)进行取材,检测指标。治疗实验在造模3个月后开始给予药物治疗,分别在给药后的1月(M1),2月(M2)和3月(M3)进行取材,检测指标。① 测量大鼠空腹时体重,处死后游离大鼠子宫和双侧肾上腺进行分别称重;②取大鼠L1-3椎体进行离体骨密度测量;③分离L2椎体进行micro-CT扫描,划定椎体感兴趣区域,并进行三维重建;④L2椎体micro-CT扫描完毕后,去除其椎体后方附件及上下终板,磨平至两端平行、约5mm高度的中心圆柱体。万能材料试验仪器以1mm/min速度进行压缩试验;⑤取L4椎体甲醛固定后,进行脱钙、脱水、包埋、切片处理,HE染色检测椎体内骨组织形态学变化;⑥取⑤中切好的白片进行TRAP染色,评估椎体骨小梁表面破骨分化情况;(2)龟板对GIOP大鼠血清AKP活性及骨转化指标的影响①取上述(1)中实验大鼠进行腹主动脉采血,离心获取血清,碱性磷酸酶测试盒检测血清AKP活性;②ELISA检测上述①中血清骨转化指标PINP和β-CTX表达水平;(3)龟板对大鼠椎体let-7f和Wnt/β-catenin通路相关因子的调控作用①取上述(1)中实验大鼠L5、L6,去除椎体附件、软组织和终板软骨,液氮保存备用。②RT-qPCR 检测上述①中 L5/6 椎体中 let-7f、TNFR2、GSK3β、β-catenin、AP-1、CTSK、MMP9、OPG、Runx2、SP7 的基因表达;③IHC检测(1)中L4椎体Runx2、CTSK的蛋白表达;④Western-blot 检测上述①中 L5/6 椎体中 TNFR2、p-GSK3 β、p-β-catenin、Runx2、CTSK蛋白表达;3.细胞实验研究(1)龟板有效成分(PTE)对BMSCs的增殖和成骨分化作用4周龄SD大鼠股骨或胫骨髓腔提取原代BMSCs,培养、传代。CCK8检测不同浓度PTE在1、3、5、7、14、21天的增殖情况;选取最佳浓度进行成骨诱导,ALP染色和茜素红染色检测PTE对BMSCs成骨分化的影响;(2)let-7f与TNFR2的靶向调控关系构建TNFR2(TNFRSF1B)点突变载体和TNFR2(TNFRSF1B)3’ UTR野生型载体,应用 LipofectamineTM 2000 试剂将 TNFRSF1B-3’ UTR 野生型载体、TNFRSF1B-MUT 突变载体与NC mimics、let-7f-5p mimics共转染细胞,双荧光素酶报告基因系统检测观察let-7f-5p对TNFRSF1B的靶向结合作用。②各组大鼠血清PINP和β-CTX水平比较预防和治疗组中,GIOP组与SHAM组比较PINP和β-CTX水平无统计学差异,但表现为升高趋势;与GIOP组比较,各治疗组PINP和β-CTX水平无统计学差异,但均呈下降趋势。(3)龟板对大鼠椎体let-7f和Wnt/β-catenin通路相关因子的调控作用①RT-qPCR检测预防实验和治疗实验中各组椎体let-7f、TNFR2、GSK3β、β-catenin、AP-1、CTSK、MMP9、OPG、Runx2、SP7 的基因表达;预防实验和治疗实验在M3时间点,与SHAM组比较,GIOP组let-7f、β-catenin表达显著降低(P<O.01),TNFR2、GSK3β表达显著上调(P<0.05),AP-1、CTSK、MP9、OPG、Runx2、和SP7表达与SHAM组无统计学差异,但仍有下调趋势。PT组和PT+ALN 组 let-7f、β-catenin 表达显著高于 GIOP 组(P<0.05),TNFR2、GSK3β 表达显著低于 GIOP 组(P<0.05),AP-1、CTSK、MMP9、OPG、Runx2、和 SP7 与 GIOP 组无统计学差异,但均表现为上调趋势。②IHC检测(1)中L4椎体Runx2、CTSK的蛋白表达;预防实验和治疗实验的M3时间点,与SHAM组比较,GIOP组Runx2表达明显降低,CTSK表达明显升高;与GIOP组比较,各治疗组Runx2明显增加,CTSK表达明显降低。其中,PT+ALN组表现最为显著。③Western-blot检测预防实验和治疗实验中各组椎体中TNFR2、p-GSK3 β、p-β-catenin、Runx2、CTSK 蛋白表达;预防和治疗实验中均显示,与SHAM组比较,GIOP组TNFR2和p-β-catenin表达显著升高(P<0.01),p-GSK3 β表达显著降低(P<0.001)。与GIOP组比较,PT和PT+ALN组TNFR2、p-β-catenin表达显著降低(P<0.05),p-GSK3 β表达显著升高(P<0.05)。;3.细胞实验研究(1)龟板有效成分(PTE)对BMSCs的增殖和成骨分化作用PTE干预7天,BMSCs增殖呈剂量增加,7天后各组细胞增殖呈剂量依赖性下降,30ug/ml浓度为PTE最佳干预浓度。成骨诱导14天后,PTE干预后的ALP阳性染色明显较强,阳性细胞数量明显增多。茜素红染色显示PTE组阳性染色细胞数量明显多于对照组。(2)let-7f与TNFR2的靶向调控关系在转染野生型TNFRSF1B-3’UTR载体细胞中,共转染let-7f-5p mimics的TNFRSF1B表达较共转染NCmimics的显著下调(P<0.001);而在转染突变型TNFRSF1B-MUT载体细胞中,共转染let-7f-5p mimics的TNFRSF1B表达与共转染NC mimics的无统计学差异(P>0.05)。结论:1.临床研究:通过高通量测序,我们发现了 GIOP椎体中2个表达上调miRNA和16个表达下调 miRNA;RT-qPCR 验证后,发现 miR-186-5p、miR-21-5p、miR-214-5p、miR-10b-5p、miR-451a 五个显著表达上调 miRNAs 和 let-7f-5p、let-7a-5p、miR-27a-3p三个显著表达下调miRNAs,这八个miRNAs在GIOP发病中可能起重要调控作用;基于测序数据、验证结果及生物信息学分析结果,通过查询KEGG Pathway数据资源,我们预测,Let-7f-5p可能靶向TNFR2调控Wnt/β-catenin通路是GIOP的发病机理。2.动物实验研究:(1)龟板防治GIOP骨损害具有明显效果,并与ALN联合应用在骨量、骨微细结构、骨生物力学及骨组织形态学等方面均显示出较好的联合效应和优势;(2)大鼠应用或撤退GC后,AKP活性均呈现先上升,后逐渐降低的趋势;龟板和龟板联合ALN能逆转前期GC诱导的AKP活性升高和后期GC诱导的AKP活性降低。(3)本研究证实,在GIOP大鼠腰椎中,在基因层面,let-7f表达下调,其靶基因TNFR2上调,Wnt信号通路关键因子GSK3β上调,β-catenin下调,而在蛋白层面,TNFR2上调,p-GSK3 β下调,p-β-catenin上调,从而导致游离β-catenin在胞质内减少,最后检测到核转录因子Runx2蛋白表达升高,应用龟板或龟板联合阿伦磷酸钠干预后能逆转GC诱导的let-7f下调和Wnt/β-catenin通路的抑制。从而验证了本研究的假说。3.细胞实验研究:(1)通过CCK8、茜素红染色和ALP染色,本研究明确了 PTE促BMSCs增殖、成骨分化和矿化能力;(2)通过荧光素酶报告基因检测,发现let-7f-5p靶向结合TNFRSF1B(TNFR2)基因的预测位点,明确了 let-7f-5p与TNFR2的靶向作用,为探讨let-7f-5p调控Wnt/β-catenin通路奠定基础。
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