论文部分内容阅读
目的
肾脏是对高血糖最敏感、亦是累及最早的器官。高血糖可直接引起肾组织损伤，进一步则导致肾脏出现不可逆功能受损。本研究遵循中医“治未病”的学术思想，选取“足三里”、“肾俞”穴，采用电针预处理的方式对链脲佐菌素(Streptozotocin , STZ)诱导的高血糖小鼠进行干预，以瞬时受体电位阳离子通道6(transient receptor potential cation channel 6，TRPC6)为切入点，探讨电针预处理减轻高血糖小鼠肾损伤的效应及其机制。
方法
采用4～6周龄雄性C57BL/6小鼠125只，体重18±2g，适应性喂养一周后开始实验，本实验过程中对动物的处置严格按照科技部[2006]398号《关于善待实验动物的指导性意见》文件要求进行，并已通过湖北中医药大学实验动物伦理委员会审批(审批编号：HUCMS201809011)。将125只小鼠按随机数字表法分为随机分为6组。人近端肾小管细胞系(Human Proximal Tubular Cells，HK-2)分为3组。
动物分组
(1)对照组(C，n=20)：正常喂养，不予其他干预。
(2)模型组(M，n=20)：实验1~7d与电针预处理组以相同方式固定小鼠，实验8~12d腹腔注射1%STZ溶液(50mg/kg体重/天)。
(3)电针预处理组(E，n=25)：实验1~7d取“足三里”、“肾俞”穴行电针预处理，采用0.18mm×13mm无菌针灸针进行针刺，“足三里”直刺，深度3mm，“肾俞”向内下方斜刺4mm，连接HANS-200电针治疗仪，采用疏密波，频率为2Hz/15Hz，梯度电流，0.3mA持续5min，0.4mA持续5min，0.5mA持续20min，共30min，每日1次，共处理7d。其中5只提取针刺血清用于细胞培养，只进行电针预处理，不做其他检测。剩余20只小鼠在实验8~12d腹腔注射STZ溶液，方式同模型组。
(4)假电针组(S，n=20)：实验1~7d固定方法及选穴同电针预处理组，针刺穴位皮下，不接电极，每次留针30min，每日1次，共处理7d。实验8~12d腹腔注射STZ溶液，方式同模型组。
(5)电针预处理+TRPC6激动剂组(ET，n=20)：于实验第1d、4d腹腔注射Hyperforindicyclohexylammoniumsalt(HP )溶液(5 mg/kg)，其余操作同电针预处理组。
(6)模型+TRPC6激动剂组(MT，n=20)：HP溶液用药方式同上，其余操作同模型组。
细胞分组
将HK-2细胞系分为3组
(1)正常组：5mmol/L葡萄糖培养细胞
(2)高糖组：25mmol/L葡萄糖培养细胞
(3)针刺血清组：针刺血清+25mmol/L葡萄糖培养细胞
以上三组细胞培养72h后开始检测。
检测方法
(1)于实验第0d及第15d称量小鼠体重，检测血糖，计量其当日摄食及排泄量。
(2)第15d血糖检测完成后，取小鼠右肾部分组织进行透射电镜检查，剩余部分提取肾组织蛋白；左肾固定后石蜡包埋，沿肾脏矢状面切片。
(3)采用HE染色观察肾组织形态，统计肾小球切面面积及受损肾小管比例；Masson和PAS染色观察和评估小鼠肾小球球内系膜基质增生程度；采用透射电镜观察各组小鼠足细胞足突变化情况；
(4)采用免疫组化法及免疫印迹法(Western-Blot，WB)检肾组织足细胞相关蛋白Neprin、WT1、Desmin表达、凋亡相关蛋白Caspase3、Bcl-2/Bax表达及TRPC6蛋白表达和ERK1/2磷酸化水平。
(5)采用Tunel法检测肾小管上皮细胞凋亡。
(6)采用钙影像检测HK-2细胞内Ca2+水平。
结果
1.“足三里”、“肾俞”电针预处理对高血糖小鼠血糖水平的影响。
与对照组比较(6.83±0.43mmol/L)，模型组小鼠血糖(13.17±0.46mmol/L)显著升高(P＜0.0001)；与模型组比较，电针预处理组小鼠血糖(10.61±0.7mmol/L)明显降低(P＜0.01)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组小鼠血糖(12.32±1.05mmol/L)上升(P＜0.05)，与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组(14.43±0.76mmol/L)小鼠血糖上升(P＜0.05)。
与对照组比较，模型组小鼠摄食量显著增加(P＜0.0001)，与模型组比较，电针预处理组小鼠摄食量明显减少(P＜0.01)；与电针组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组小鼠摄食量明显增加(P＜0.01)，与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组小鼠摄食量明显增加(P＜0.01)。
与对照组比较，模型组小鼠排泄量显著增加(P＜0.0001)，与模型组比较，电针预处理组小鼠排泄量明显减少(P＜0.01)；与电针组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组小鼠排泄量明显增加(P＜0.01)，与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组小鼠排泄量明显增加(P＜0.01)；
2.“足三里”、“肾俞”电针预处理对高血糖小鼠肾组织损伤的影响
HE染色可见，与对照组比较，模型组小鼠肾脏肾小球体积明显增大(P＜0.0001)，近端小管刷状缘大量消失(P＜0.0001)；与模型组比较，电针预处理组小鼠肾脏肾小球体积较小(P＜0.05)，近端小管刷状缘消失亦较少(P＜0.0001)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组肾小球显著增大(P＜0.0001)，肾小管刷装缘消失增多(P＜0.05)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组小鼠肾小球显著增大(P＜0.0001)，刷状缘消失的近端小管比例增加(P＜0.05)。
Masson及PAS染色可见，与对照组比较，模型组小鼠肾小球球内系膜基质明显增生；与模型组比较，电针预处理组球内系膜基质增生不明显；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组球内系膜基质增生更明显；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组球内系膜基质增生更明显。
3.“足三里”、“肾俞”电针预处理对足细胞损伤的影响
采用透射电镜观察各组小鼠足突变化，结果显示：模型组及假电针组小鼠足突出现明显回缩、融合，电针预处理组足突变化不明显。
采用免疫组化法检测各组小鼠肾脏Desmin蛋白的表达，与对照组比较，模型组Desmin蛋白表达显著增加(P＜0.0001)；与模型组比较，电针预处理组Desmin蛋白表达明显降低(P＜0.01)。与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Desmin蛋白表达显著增加(P＜0.001)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Desmin蛋白表达明显增加(P＜0.01)。Western-blot法检测各组小鼠肾脏Desmin蛋白的表达与对照组比较，模型组Desmin蛋白表达明显增加(P＜0.0001)；与模型组比较，电针预处理组Desmin蛋白表达显著降低(P＜0.001)。与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Desmin蛋白表达明显增加(P＜0.01)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Desmin蛋白表达明显增加(P＜0.01)。
免疫组化检测各组小鼠肾组织Nephrin的表达，结果显示：与对照组比较，模型组Nephrin表达明显上调(P＜0.01)，与模型组比较，电针预处理组Nephrin表达下调(P＜0.05)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Nephrin表达上调(P＜0.05)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Nephrin表达上调(P＜0.05)。WB检测各组小鼠肾组织Nephrin的表达水平，结果显示：与对照组比较，模型组Nephrin表达水平明显上调(P＜0.01)，与模型组比较，电针预处理组Nephrin表达水平下调(P＜0.05)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Nephrin表达水平明显上调(P＜0.01)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Nephrin表达水平上调(P＜0.05)。
采用免疫组化检测肾脏WT1蛋白表达及定位，肾小球内的阳性细胞即为足细胞，统计各组足细胞数，结果显示各组足细胞数量差异无统计学意义。
4.“足三里”、“肾俞”电针预处理对高血糖小鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响
与对照组比较，模型组小鼠肾小管上皮细胞凋亡比例显著增加(P＜0.0001)；与模型组比较，电针预处理组肾小管上皮细胞凋亡比例显著减少(P＜0.0001)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组肾小管上皮细胞凋亡比例显著增加(P＜0.0001)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组肾小管上皮细胞凋亡比例明显增加(P＜0.01)。
免疫组化检测各组小鼠肾组织Caspase3的表达，结果显示：与对照组比较，模型组Caspase3表达水平显著上调(P＜0.001)，与模型组比较，电针预处理组Caspase3表达水平明显下调(P＜0.01)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Caspase3表达水平上调(P＜0.05)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Caspase3表达水平上调(P＜0.05)。WB检测各组小鼠肾组织Caspase3的表达水平，结果显示：与对照组比较，模型组Caspase3表达水平显著上调(P＜0.0001)，与模型组比较，电针预处理组Caspase3表达水平显著下调(P＜0.0001)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Caspase3表达水平明显上调(P＜0.001)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Caspase3表达水平明显上调(P＜0.01)。WB检测各组小鼠肾组织Bax/Bcl-2的表达比值，结果显示：与对照组比较，模型组Bcl-2/Bax比值显著降低(P＜0.0001)，与模型组比较，电针预处理组Bcl-2/Bax比值明显明显升高(P＜0.001)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Bcl-2/Bax比值明显显著降低(P＜0.001)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Bcl-2/Bax比值明显明显降低(P＜0.01)。
5“足三里”、“肾俞”电针预处理对高血糖小鼠肾肾脏TRPC6表达及ERK磷酸化的影响
(1)免疫组化法检测各组小鼠肾脏TRPC6的表达，结果显示：与对照组比较，模型组TRPC6表达水平显著上调(P＜0.001)，与模型组比较，电针预处理组TRPC6表达水平下调(P＜0.05)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组肾小球区域TRPC6表达水平上调(P＜0.05)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组肾小球区域TRPC6表达水平上调(P＜0.05)。WB的结果显示：与对照组比较，模型组TRPC6表达水平明显上调(P＜0.01)，与模型组比较，电针预处理组TRPC6表达水平下调(P＜0.05)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组TRPC6表达水平明显上调(P＜0.01)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组TRPC6表达水平明显上调(P＜0.01)。
免疫组化WB检测各组小鼠肾组织ERK磷酸化水平，结果显示：与对照组比较，模型组ERK磷酸化水平明显上调(P＜0.01)，与模型组比较，电针预处理组ERK磷酸化水平明显下调(P＜0.05)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组ERK磷酸化水平明显上调(P＜0.01)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组ERK磷酸化水平明显上调(P＜0.01)。各组JNK及P38磷酸化水平差异无统计学意义。
6.针刺血清对HK-2细胞内Ca2+浓度的影响
采用钙影像检测各组HK-2细胞内Ca2+浓度，结果显示，与正常组HK-2细胞比较，高糖组HK-2细胞内Ca2+浓度明显升高(P＜0.01)，与高糖组比较，针刺血清培养的HK-2细胞内Ca2+浓度显著降低(P＜0.001)。
结论
(1)“足三里”、“肾俞”电针预处理可明显抑制STZ诱导的小鼠血糖升高、改善小鼠一般状况。
(2)“足三里”、“肾俞”电针预处理可通过减少足细胞损伤、抑制肾小管上皮细胞凋亡发挥肾脏保护效应。
(3)“足三里”、“肾俞”电针预处理的肾脏保护效应可能是通过下调TRPC6的表达、减少ERK磷酸化实现的。
肾脏是对高血糖最敏感、亦是累及最早的器官。高血糖可直接引起肾组织损伤，进一步则导致肾脏出现不可逆功能受损。本研究遵循中医“治未病”的学术思想，选取“足三里”、“肾俞”穴，采用电针预处理的方式对链脲佐菌素(Streptozotocin , STZ)诱导的高血糖小鼠进行干预，以瞬时受体电位阳离子通道6(transient receptor potential cation channel 6，TRPC6)为切入点，探讨电针预处理减轻高血糖小鼠肾损伤的效应及其机制。
方法
采用4～6周龄雄性C57BL/6小鼠125只，体重18±2g，适应性喂养一周后开始实验，本实验过程中对动物的处置严格按照科技部[2006]398号《关于善待实验动物的指导性意见》文件要求进行，并已通过湖北中医药大学实验动物伦理委员会审批(审批编号：HUCMS201809011)。将125只小鼠按随机数字表法分为随机分为6组。人近端肾小管细胞系(Human Proximal Tubular Cells，HK-2)分为3组。
动物分组
(1)对照组(C，n=20)：正常喂养，不予其他干预。
(2)模型组(M，n=20)：实验1~7d与电针预处理组以相同方式固定小鼠，实验8~12d腹腔注射1%STZ溶液(50mg/kg体重/天)。
(3)电针预处理组(E，n=25)：实验1~7d取“足三里”、“肾俞”穴行电针预处理，采用0.18mm×13mm无菌针灸针进行针刺，“足三里”直刺，深度3mm，“肾俞”向内下方斜刺4mm，连接HANS-200电针治疗仪，采用疏密波，频率为2Hz/15Hz，梯度电流，0.3mA持续5min，0.4mA持续5min，0.5mA持续20min，共30min，每日1次，共处理7d。其中5只提取针刺血清用于细胞培养，只进行电针预处理，不做其他检测。剩余20只小鼠在实验8~12d腹腔注射STZ溶液，方式同模型组。
(4)假电针组(S，n=20)：实验1~7d固定方法及选穴同电针预处理组，针刺穴位皮下，不接电极，每次留针30min，每日1次，共处理7d。实验8~12d腹腔注射STZ溶液，方式同模型组。
(5)电针预处理+TRPC6激动剂组(ET，n=20)：于实验第1d、4d腹腔注射Hyperforindicyclohexylammoniumsalt(HP )溶液(5 mg/kg)，其余操作同电针预处理组。
(6)模型+TRPC6激动剂组(MT，n=20)：HP溶液用药方式同上，其余操作同模型组。
细胞分组
将HK-2细胞系分为3组
(1)正常组：5mmol/L葡萄糖培养细胞
(2)高糖组：25mmol/L葡萄糖培养细胞
(3)针刺血清组：针刺血清+25mmol/L葡萄糖培养细胞
以上三组细胞培养72h后开始检测。
检测方法
(1)于实验第0d及第15d称量小鼠体重，检测血糖，计量其当日摄食及排泄量。
(2)第15d血糖检测完成后，取小鼠右肾部分组织进行透射电镜检查，剩余部分提取肾组织蛋白；左肾固定后石蜡包埋，沿肾脏矢状面切片。
(3)采用HE染色观察肾组织形态，统计肾小球切面面积及受损肾小管比例；Masson和PAS染色观察和评估小鼠肾小球球内系膜基质增生程度；采用透射电镜观察各组小鼠足细胞足突变化情况；
(4)采用免疫组化法及免疫印迹法(Western-Blot，WB)检肾组织足细胞相关蛋白Neprin、WT1、Desmin表达、凋亡相关蛋白Caspase3、Bcl-2/Bax表达及TRPC6蛋白表达和ERK1/2磷酸化水平。
(5)采用Tunel法检测肾小管上皮细胞凋亡。
(6)采用钙影像检测HK-2细胞内Ca2+水平。
结果
1.“足三里”、“肾俞”电针预处理对高血糖小鼠血糖水平的影响。
与对照组比较(6.83±0.43mmol/L)，模型组小鼠血糖(13.17±0.46mmol/L)显著升高(P＜0.0001)；与模型组比较，电针预处理组小鼠血糖(10.61±0.7mmol/L)明显降低(P＜0.01)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组小鼠血糖(12.32±1.05mmol/L)上升(P＜0.05)，与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组(14.43±0.76mmol/L)小鼠血糖上升(P＜0.05)。
与对照组比较，模型组小鼠摄食量显著增加(P＜0.0001)，与模型组比较，电针预处理组小鼠摄食量明显减少(P＜0.01)；与电针组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组小鼠摄食量明显增加(P＜0.01)，与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组小鼠摄食量明显增加(P＜0.01)。
与对照组比较，模型组小鼠排泄量显著增加(P＜0.0001)，与模型组比较，电针预处理组小鼠排泄量明显减少(P＜0.01)；与电针组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组小鼠排泄量明显增加(P＜0.01)，与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组小鼠排泄量明显增加(P＜0.01)；
2.“足三里”、“肾俞”电针预处理对高血糖小鼠肾组织损伤的影响
HE染色可见，与对照组比较，模型组小鼠肾脏肾小球体积明显增大(P＜0.0001)，近端小管刷状缘大量消失(P＜0.0001)；与模型组比较，电针预处理组小鼠肾脏肾小球体积较小(P＜0.05)，近端小管刷状缘消失亦较少(P＜0.0001)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组肾小球显著增大(P＜0.0001)，肾小管刷装缘消失增多(P＜0.05)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组小鼠肾小球显著增大(P＜0.0001)，刷状缘消失的近端小管比例增加(P＜0.05)。
Masson及PAS染色可见，与对照组比较，模型组小鼠肾小球球内系膜基质明显增生；与模型组比较，电针预处理组球内系膜基质增生不明显；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组球内系膜基质增生更明显；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组球内系膜基质增生更明显。
3.“足三里”、“肾俞”电针预处理对足细胞损伤的影响
采用透射电镜观察各组小鼠足突变化，结果显示：模型组及假电针组小鼠足突出现明显回缩、融合，电针预处理组足突变化不明显。
采用免疫组化法检测各组小鼠肾脏Desmin蛋白的表达，与对照组比较，模型组Desmin蛋白表达显著增加(P＜0.0001)；与模型组比较，电针预处理组Desmin蛋白表达明显降低(P＜0.01)。与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Desmin蛋白表达显著增加(P＜0.001)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Desmin蛋白表达明显增加(P＜0.01)。Western-blot法检测各组小鼠肾脏Desmin蛋白的表达与对照组比较，模型组Desmin蛋白表达明显增加(P＜0.0001)；与模型组比较，电针预处理组Desmin蛋白表达显著降低(P＜0.001)。与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Desmin蛋白表达明显增加(P＜0.01)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Desmin蛋白表达明显增加(P＜0.01)。
免疫组化检测各组小鼠肾组织Nephrin的表达，结果显示：与对照组比较，模型组Nephrin表达明显上调(P＜0.01)，与模型组比较，电针预处理组Nephrin表达下调(P＜0.05)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Nephrin表达上调(P＜0.05)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Nephrin表达上调(P＜0.05)。WB检测各组小鼠肾组织Nephrin的表达水平，结果显示：与对照组比较，模型组Nephrin表达水平明显上调(P＜0.01)，与模型组比较，电针预处理组Nephrin表达水平下调(P＜0.05)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Nephrin表达水平明显上调(P＜0.01)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Nephrin表达水平上调(P＜0.05)。
采用免疫组化检测肾脏WT1蛋白表达及定位，肾小球内的阳性细胞即为足细胞，统计各组足细胞数，结果显示各组足细胞数量差异无统计学意义。
4.“足三里”、“肾俞”电针预处理对高血糖小鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响
与对照组比较，模型组小鼠肾小管上皮细胞凋亡比例显著增加(P＜0.0001)；与模型组比较，电针预处理组肾小管上皮细胞凋亡比例显著减少(P＜0.0001)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组肾小管上皮细胞凋亡比例显著增加(P＜0.0001)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组肾小管上皮细胞凋亡比例明显增加(P＜0.01)。
免疫组化检测各组小鼠肾组织Caspase3的表达，结果显示：与对照组比较，模型组Caspase3表达水平显著上调(P＜0.001)，与模型组比较，电针预处理组Caspase3表达水平明显下调(P＜0.01)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Caspase3表达水平上调(P＜0.05)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Caspase3表达水平上调(P＜0.05)。WB检测各组小鼠肾组织Caspase3的表达水平，结果显示：与对照组比较，模型组Caspase3表达水平显著上调(P＜0.0001)，与模型组比较，电针预处理组Caspase3表达水平显著下调(P＜0.0001)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Caspase3表达水平明显上调(P＜0.001)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Caspase3表达水平明显上调(P＜0.01)。WB检测各组小鼠肾组织Bax/Bcl-2的表达比值，结果显示：与对照组比较，模型组Bcl-2/Bax比值显著降低(P＜0.0001)，与模型组比较，电针预处理组Bcl-2/Bax比值明显明显升高(P＜0.001)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组Bcl-2/Bax比值明显显著降低(P＜0.001)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组Bcl-2/Bax比值明显明显降低(P＜0.01)。
5“足三里”、“肾俞”电针预处理对高血糖小鼠肾肾脏TRPC6表达及ERK磷酸化的影响
(1)免疫组化法检测各组小鼠肾脏TRPC6的表达，结果显示：与对照组比较，模型组TRPC6表达水平显著上调(P＜0.001)，与模型组比较，电针预处理组TRPC6表达水平下调(P＜0.05)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组肾小球区域TRPC6表达水平上调(P＜0.05)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组肾小球区域TRPC6表达水平上调(P＜0.05)。WB的结果显示：与对照组比较，模型组TRPC6表达水平明显上调(P＜0.01)，与模型组比较，电针预处理组TRPC6表达水平下调(P＜0.05)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组TRPC6表达水平明显上调(P＜0.01)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组TRPC6表达水平明显上调(P＜0.01)。
免疫组化WB检测各组小鼠肾组织ERK磷酸化水平，结果显示：与对照组比较，模型组ERK磷酸化水平明显上调(P＜0.01)，与模型组比较，电针预处理组ERK磷酸化水平明显下调(P＜0.05)；与电针预处理组比较，电针预处理+TRPC6激动剂组ERK磷酸化水平明显上调(P＜0.01)；与模型组比较，模型+TRPC6激动剂组ERK磷酸化水平明显上调(P＜0.01)。各组JNK及P38磷酸化水平差异无统计学意义。
6.针刺血清对HK-2细胞内Ca2+浓度的影响
采用钙影像检测各组HK-2细胞内Ca2+浓度，结果显示，与正常组HK-2细胞比较，高糖组HK-2细胞内Ca2+浓度明显升高(P＜0.01)，与高糖组比较，针刺血清培养的HK-2细胞内Ca2+浓度显著降低(P＜0.001)。
结论
(1)“足三里”、“肾俞”电针预处理可明显抑制STZ诱导的小鼠血糖升高、改善小鼠一般状况。
(2)“足三里”、“肾俞”电针预处理可通过减少足细胞损伤、抑制肾小管上皮细胞凋亡发挥肾脏保护效应。
(3)“足三里”、“肾俞”电针预处理的肾脏保护效应可能是通过下调TRPC6的表达、减少ERK磷酸化实现的。