超电荷绿色荧光蛋白(ScGFP)是一种表面带很高净电荷的新型功能蛋白，通过遗传修饰的手段对绿色荧光蛋白进行表面重构获得的。ScGFP具有很强的水溶性和抗蛋白聚集的能力，在生物技术，医药和材料科学方面有着广泛的应用前景。此外，带正电荷的ScGFP能够穿透细胞膜，具有运载核酸和蛋白质等生物大分子进入哺乳动物细胞内的能力。与传统的转运载体相比，ScGFP有细胞毒性低，转运效率高和广泛的细胞普适性等优点。带正电荷的ScGFP与带负电荷的电核酸分子之间通过静电相互作用形成自组装的多离子复合物，这与生物体中组蛋白和带负电的DNA之间自组装成染色质的行为非常相似。ScGFP具有很强的稳定性，穿透细胞膜的能力，以及与核酸之间有很强的静电相互作用等特性，因此，可以基于ScGFP来开发用于生化分析的传感平台。但是到目前为止，ScGFP在生化检测中的应用还非常少。本文利用ScGFP(+36)作为识别和信号响应元件，开发了一个基于ScGFP的简单通用的传感平台，用于重大疾病相关的生物标志物的检测。本文的要点归纳如下：(1)构建用于原核表达ScGFP的重组载体，以及ScGFP的表达和纯化。从ScGFP的氨基酸残基序列反推出ScGFP的基因序列(scgfp)，并结合大肠杆菌偏好的密码子系统对序列进行优化。携带ScGFP的基因序列的质粒pUC19-scgfp通过全基因人工合成的方式获得。将质粒pUC19-scgfp和pET28混合于一个PCR管中，然后通过“一锅法”获得重组质粒pET28-scgfp。本文中发展的“一锅法”能够在2h内完成重组质粒的构建工作，所有过程在同一个PCR管中完成，无需额外的DNA分离和回收步骤。将质粒转入pET28-scgfp大肠杆菌中，进行诱导表达ScGFP。在AKTA purifier蛋白纯化系统上通过Ni-NTA柱和脱盐柱进行纯化，获得了高纯度的ScGFP。(2) ScGFP与DNA之间的静电相互作用。以20bp的DNA作为模型，研究发现，ScGFP/DNA纳米复合体形成速度非常快(20s)，经动态光散射表征发现，复合体的平均粒径为568±46nm，并且进一步地通过原子力显微镜表征得到证实。此外，能够用共聚焦荧光显微镜直接观察到ScGFP/DNA纳米复合体。形成ScGFP/DNA纳米复合体后，ScGFP的荧光增强了~40%，这可能是因为ScGFP分子的周围微观环境发生了改变。此外，ScGFP被包裹到ScGFP/DNA纳米复合体中时，荧光各向异性显著地降低，从0.3减小到0.07，这是由于复合体中紧邻的ScGFP分子之间发生了homo-FRET。当DNA被标记上猝灭基团时，ScGFP/DNA纳米复合体中ScGFP的荧光被高效的猝灭，最大猝灭率达到了95%。基于DNA浓度依赖的荧光猝灭曲线，计算出ScGFP与20bp的DNA的解离常数(Kd)为0.33nM。(3) ScGFP作为简单而通用的探针用于DNA检测和DNA甲基化分析。作为一个原理的验证，本文发展了ScGFP的一个新的应用领域，即作为一个通用的传感平台用于核酸检测和表观遗传学分析。将ScGFP作为信号报道分子，基于多离子的ScGFP/DNA纳米复合物和支点介导的链取代反应，发展了一个简单的“turn-on”模式来检测DNA的新方法。该分析方法具有较高的灵敏度(检测限1nM)和很好的区分单碱基错配的能力(目标DNA序列与单碱基错配的序列的信号相差10倍)。此外，与重亚硫酸盐处理相结合，这个基于ScGFP的分析方法被进一步用于高灵敏地分析结肠癌组织样品的基因组DNA中特定位点的甲基化水平。(4) ScGFP作为一个通用的传感平台用于核酸酶和甲基转移酶酶活性分析。本文中，基于多离子的ScGFP/DNA纳米复合体，发展了一个灵敏的“switch-on”模式的生物传感平台，用于限制性和非限制性核酸酶，以及甲基转移酶活性的分析。S1核酸酶对探针DNA的切割导致猝灭基团从探针上释放和远离ScGFP，继而使得ScGFP的荧光得到恢复。因此，实现了对S1核酸酶活性简单的“turn-on”模式的分析，该分析方法具有较宽的线性范围(0.008–0.4U/mL)和低的检测限(0.002U/mL)。基于同样的传感策略，对探针DNA进行适当改变，该分析方法实现了对限制性内切酶EcoRI高灵敏度分析(检测限1.3U/mL)。类似地，借助甲基化敏感的限制性内切酶DpnI，本方法又进一步应用到Dam甲基转移酶活性检测和抑制剂分析。(5) H39GFP作为一个新型传感平台用于免标记检测金属离子和酶活性。蛋白表面重构是对一个蛋白质的表面进行重新设计，而保留蛋白原有的折叠和功能的技术。H39GFP，一种通过蛋白表面重构技术开发出的一级结构中包含了39个组氨酸残基的新型绿色荧光蛋白。H39GFP有很多优良的性质，包括异常的稳定性，穿透细胞膜的能力和可调控的表面净电荷等。本文中，利用H39GFP作为信号识别和报道分子，基于Cu2+的荧光猝灭效应和H39GFP的多价的金属离子结合位点，开发了一个免标记的Cu2+荧光传感器。研究发现，H39GFP与Cu2+之间的结合速度很快并且具有很高的结合力(Kd=16.2nM)。该分析方法提供了一个简单的“混合-读取”的方式来检测Cu2+,对50nM–2.0μM的Cu2+有线性响应，最低检测浓度为50nM。此外，进一步将基于H39GFP的Cu2+分析方法用于乙酰胆碱酯酶(AChE)活性检测及其抑制剂筛选。 AChE水解硫代乙酰胆碱(ATC)生成硫代胆碱(thiocholine),硫代胆碱与Cu2+反应生成Cu-(thiocholine)2，从而使H39GFP的荧光恢复，实现“switch-on”模式检测AChE活性。本方法实现了对AChE的高灵敏和特异性的检测，检测限为0.015mU/mL。他克林和西维因这两种抑制剂用于研究对AChE催化ATC水解反应的抑制作用。他克林对AChE抑制作用的IC50值为3.5nM，西维因的抑制效率与西维因的浓度的对数值呈线性关系并计算出检测限为7.03×10-9g/L。此外，将该传感方法进一步用于检测食物样品中的西维因残留，得到的结果与高效液相色谱法相符。