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研究目的:多囊卵巢综合征(PCOS)是生育年龄女性最常见的内分泌异常和代谢障碍性疾病,发病率占全球育龄女性5%~10%。持续性无排卵,雄激素过多和胰岛素抵抗(IR)是其重要特征。IR在PCOS发病机制中起着重要的作用,50-70%患者存在不同程度的IR,但其机制尚未清楚。本实验旨在通过高脂饮食加来曲唑构建SD雌性大鼠多囊卵巢综合征-胰岛素抵抗(PCOS-IR)动物模型,分析PI3K/AKT信号通路与PCOS-IR的关系,研究二甲双胍对PCOS-IR大鼠的卵巢和肝脏组织中PI3K、AKT基因和蛋白的水平变化,探讨PI3K/AKT信号通路在二甲双胍影响多囊卵巢综合征大鼠胰岛素抵抗的分子机制及意义,从而指导PCOS的临床治疗。研究方法:1.实验动物及分组1.1实验动物:选取6周龄(185±10g)健康雌性Spragu Dawley(SD)雌性大鼠32只。购自广东省动物中心。1.2随机分组:正常对照组8只,模型组8只,二甲双胍组8只,二甲双胍+阻断剂组8只。2.实验方法2.1 PCOS-IR模型建立:采用髙脂饮食喂养联合来曲唑构建SD雌性大鼠PCOS-IR模型,模型组给予来曲唑(1mg/kg/d)刺激并喂以高脂饲料,正常组给予双蒸水并喂以普通饲料,连续30天。将大鼠分为四组,二甲双胍组大鼠用二甲双胍(300mg/kg/d)灌胃干预,二甲双胍+阻断剂组采用二甲双胍灌胃+LY294002尾静脉注射干预,正常组和模型组灌予等容量双蒸水。2.2通过大鼠阴道细胞涂片观察动情周期;测大鼠总体重和双侧卵巢重量。2.3酶联免疫吸附法(ELISA)检测四组大鼠外周血清睾酮(T)、雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、LH/FSH;代谢指标空腹胰岛素(FINS),空腹血糖(FBG);计算稳态模型评估胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。2.4 HE染色方法观察四组PCOS大鼠卵巢病理组织结构变化。2.5腹腔注射葡萄糖实验评估胰岛素抵抗。2.6采用半定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)法检测四组卵巢和肝脏组织PI3K m RNA、AKT m RNA的表达量。2.7采用Western-Blot方法检测四组卵巢和肝脏组织中p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平。结果:1.模型构建:模型组大鼠总体重、卵巢重量显著高于正常组(320.51±19.08 vs 246.60±10.21、88.44±7.01vs 66.87±7.53,P<0.01)。模型组大鼠血清T(4.07±3.41 vs 0.65±0.14)、LH(12.88±14.0 vs 0.88±0.35)、LH/FSH(5.45±6.01vs 0.19±0.09)比正常组显著升高,P<0.01,血清FSH水平较正常组降低(2.53±1.25 vs 5.46±2.65,P<0.05)。模型组血清E2水平较之对照组略升高,但差异无统计学意义。卵巢组织病理切片显示:模型组卵巢有较多的囊状扩张卵泡及闭锁卵泡,卵泡及黄体数目明显减少,颗粒细胞数减少。正常组可见不同发育阶段的卵泡及多个黄体,颗粒细胞层数多。模型组大鼠空腹血糖、胰岛素和HOMA-IR与正常相比明显增高(6.84±0.17 vs 4.69±0.36,P<0.01;37.93±4.06 vs19.58±2.19,P<0.05;11.45±1.83 vs 4.04±0.48,P<0.05)。两组血糖均在糖负荷15min后达到峰值,且模型组在糖负荷120min后血糖值仍无明显回落,显著高于正常组(8.18±2.23mmol/Lvs5.14±0.43mmol/L,P〈0.05)。模型组大鼠葡萄糖曲线下面积(AUCglu)明显比正常组大(24.37±0.66mmol/Lvs12.94±1.39mmol/L,P<0.05)。2.建模成功后,与模型组比,给予二甲双胍治疗后显发现示大鼠外周血血清性激素T、LH和FBG、FINS等代谢指标显著降低,而给予PI3K/AKT通路阻断剂-LY294002干预后发现可阻断二甲双胍对PCOS的生殖激素紊乱和IR的改善。通过检测大鼠PI3K和AKT的基因和蛋白表达量发现,模型组大鼠肝脏和卵巢组织PI3Km RNA表达量显著低于正常组(0.59±0.09 vs 1.03±0.21;0.44±0.07 vs 1.01±0.17,P<0.05)。AKT m RNA表达量趋势同上(0.57±0.20vs 1.01±0.13;0.57±0.13 vs 1.01±0.26,P<0.05)。给予二甲双胍后,与模型组相比,大鼠肝脏和卵巢组织PI3K和AKTm RNA明显上升,分别是(0.92±0.23 vs0.59±0.09;0.82±0.13vs 0.44±0.07,P<0.05)和(0.74±0.10vs 0.57±0.20,P<0.01;0.81±0.34vs 0.57±0.13,P<0.01)。阻断剂LY294002干预后,可阻断肝脏和卵巢组织PI3K和AKTm RNA的表达。大鼠肝脏和卵巢PI3K和AKT的蛋白表达量与其基因变化趋势一样。结论:1.成功建立了来曲唑联合高脂饮食喂养诱导的PCOS-IR大鼠动物模型,对该模型从卵巢形态学、内分泌学等方面进行研究,其病理形态与人类PCOS非常相似,且存在IR。因此,认为该模型是一种比较理想的研究PCOS-IR的动物模型。1.二甲双胍可改善PCOS大鼠卵巢多囊样改变和胰岛素抵抗。2.二甲双胍可能通过PI3K/AKT信号通路影响PCOS大鼠卵巢的胰岛素抵抗作用。