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中国是最大的养禽国,然而病毒病的流行一直困扰着养禽业,给养禽业造成了巨大的经济损失。目前一些禽类病毒性疾病仍然缺乏有效的治疗手段,化学药物的使用易造成耐药性,且容易引起动物体内药物残留而影响人类健康,疫苗的研制则须考虑病毒变异和多样性。因此,急需研制出安全、高效、新型的抗病毒制剂和免疫增强剂用于增强鸡体的抵抗力和提高现有疫苗的保护率。干扰素是一类动物机体产生的多功能蛋白,它可由病毒感染而自发产生并随血液循环至全身,激活细胞内抗病毒作用机制合成各种抗病毒蛋白以抵抗病毒的侵扰。由于它高效的广谱抗病毒活性和免疫调节活性以及其无可替代的临床应用价值,从人类发现干扰素开始,就从未停止过对它的探索研究。近年来,各种动物干扰素的研究取得了突破性进展,在体外干扰素既可以单独应用于疾病的防治,又可以与疫苗联合应用,增强和改善疫苗的免疫效果,尤其是α干扰素在抗病毒感染等方面显出良好的效果。近年来,鸡干扰素(chicken interferon, ChIFN)的抗病毒和疫苗佐剂功能也在更多的试验中被发现和证实。本研究的目的就是应用基因工程和蛋白质工程技术研制出具有自主知识产权的重组鸡α干扰素并研究其抗病毒功能和对疫苗的免疫增强作用,为我国重组鸡干扰素的工程化生产及其在养鸡业中的应用奠定基础。研究主要从以下几个方面展开：1鸡α干扰素是一个多基因家族,具有20多种亚型,不同亚型间的生物学活性也有差异。利用DNA Star分子生物学软件,对不同品种鸡α干扰素不同亚型的基因序列进行比较分析,筛选出同源性较高的基因序列,并根据毕赤酵母的偏嗜性,换用毕赤酵母的优势密码子,改变其成熟蛋白基因碱基序列,设计出一条新的鸡α干扰素碱基序列,共507bp,利用primer premier 5.0分子生物学软件,将该碱基序列设计成14条基因片段,相邻两条引物之间相互重叠15-22bp,SOE方法拼接该目的基因,将拼接好的该基因序列,连接到酵母表达载体pPICZα-A,构建表达载体为pPICZα-A-ChIFN-α。pPICZα-A-ChIFN-α经Sac I酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导。SDS-PAGE蛋白电泳显示,pPICZα-A-ChIFN-α在毕赤酵母系统中进行了分泌表达,蛋白含量约为0.143mg·mL-1。经VSV-CEF活性测定系统,测定其抗病毒活性约为1.76×106U mL-1,比活性为1.23×107U·mg-1。本实验实现了非天然干扰素在毕赤酵母中的成功表达,并具有较高的表达量和抗病毒活性。2在人类干扰素,利用点突变成功研究了个别氨基酸的改变引起其生物学功能发生变化,以此来研究出干扰素的基因结构与其功能的相互关系,在此基础上,我们通过对比鸡、人干扰素的氨基酸序列,发现其C端有较高的同源性。依据人类IFN-α点突变方式,我们对鸡的IFN-α进行了点突变,设计了五个突变体,分别为突变体Mutl: V141 I, R142S, A145Y;突变体Mut2:V141L, R142S, A145Y;突变体Mut3:W138H, V141I, R142S,, A145Y, W148S, L150S;突变体Mut4:L114S;突变体Mut5:L114S, W138H, V141I, R142S, A145Y, W148S, L150S;每个突变体分别设计14条基因片段,利用SOE拼接扩增而成,构建酵母表达系统并进行了成功表达,蛋白量在表达水平上没有显著差异。用VSV-CEF系统测定其活性,与未经改造的干扰素进行比较：五个突变体活性差异较大,其中突变体Mut1和突变体Mut2活性较高,较未突变的干扰素活性分别提高了28倍和15倍；突变体Mut4活性和原来相近；突变体Mut3和突变体Mut5活性较低,较未突变干扰素相比分别下降了32倍和23倍。结合已证实和预测的结构进行分析,发现：鸡Ⅰ型α干扰素的受体结合部位位于第29-35位点氨基酸及第123-140位点氨基酸,IFN的C端对抗病毒、抗增殖活性有影响,氨基酸的突变有利于增强其组织亲和力,提高其生物学活性。3在鸡胚成纤维细胞上研究了重组鸡α干扰素对禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)的抗病毒效果,结果表明：重组鸡α干扰素可降低AIV在鸡胚成纤维细胞上的增殖滴度,1000U/mL和100U/mL的重组α鸡干扰素处理的鸡胚成纤维细胞中AIV的滴度分别比对照降低2.76 Log10TCID50和1.93Log10 TCID50,高浓度的干扰素抑制作用更显著；重组鸡α干扰素对NDV在鸡胚成纤维细胞中的抑制作用更为明显,1000U/mL和100U/mL的重组α鸡干扰素处理的鸡胚成纤维细胞中强毒株的滴度分别比对照降低1.73 Log10TCID50和0.89 Log10 TCID50,1000U/mL的重组鸡α干扰素可以完全抑制100TCID50/mL新城疫病毒在鸡胚成纤维细胞上产生病变。4使用重组鸡α干扰素蛋白作为免疫佐剂,检测鸡α干扰素蛋白对禽流感病毒H9N2亚型灭活疫苗的免疫调节作用。将20日龄的海兰白蛋鸡,随机分为6组,采用胸部肌肉注射方式进行免疫,对照组仅接种H9N2亚型禽流感灭活疫苗,试验组分别同时接种H9N2亚型禽流感灭活疫苗0.3 mL和不同剂量(5000U-100万U)的重组鸡α干扰素。免疫后每7d静脉采血,采用血凝和血凝抑制方法检测机体中抗体水平。结果表明,重组鸡α干扰素蛋白对H9N2亚型禽流感灭活疫苗具有免疫增强作用。综合抗体滴度的消长特性和细胞免疫指标,使用10万U/头份的重组鸡α-干扰素作为AIVH9N2灭活苗佐剂,可取得较为理想的效果。