大丽轮枝菌宿主广泛,如茄子、棉花、番茄等,感病的植物会出现叶片萎蔫、维管黄褐等症状,甚至整株枯死,严重危害我国经济作物产量。为成功入侵宿主植物,大丽轮枝菌可通过干扰植物免疫反应,比如分泌作用于植物细胞核的效应子等,影响植物防御反应。在真菌侵染过程中,植物细胞核中的调节蛋白会激活相应的防御反应,抵御真菌侵染。因此,植物细胞核作为病原菌入侵的主要调控靶标,又是植物防御反应的调控中心,了解病原菌入侵植物细胞过程中细胞核蛋白组的变化对我们认识病原真菌的侵染机制及植物的防御反应机制具有重要意义。为探究真菌侵染过程中植物细胞核蛋白组分的变化,需要分离鉴定获得特异细胞器（细胞核）蛋白组。APEX（抗坏血酸过氧化物酶）作为邻近标记技术工具酶之一,在标记过程中产生苯氧自由基,且苯氧自由基存在的时间较短（<1 ms）,标记范围小（<20 nm）,产生的苯氧自由基可以与Tyr,Trp,His和Cys等富含电子的氨基酸共价连接,完成原位生物素标记。APEX为邻近标记提供了一种新的方法,利用APEX可捕获特定环境中的原位蛋白,为我们提供目标蛋白质的原位时空信息。但APEX邻近标记技术尚未在植物中运用,本研究以拟南芥、棉花作为植物受体,探究APEX在植物中的运用,并对受大丽轮枝菌感染的拟南芥及棉花核蛋白进行分离鉴定。主要研究结果如下:1.NLS-APEX的亚细胞定位验证构建了具核定位信号（NLS）及eGFP的融合蛋白NLS-APEX-eGFP基因,构建进植物表达载体pLGN-35S,获得pLGN-35S-NLS-APEX-eGFP。利用农杆菌GV3101介导的烟草瞬时表达,观察eGFP亚细胞定位情况。烟草叶片通过DAPI染色后,eGFP信号同DAPI荧光信号共定位,表明NLS-APEX对植物细胞核具有靶向性,且pLGN-35S-NLS-APEX-eGFP转基因拟南芥中也得到一致的结果。2.APEX在拟南芥、棉花中标记条件的优化我们利用农杆菌介导的植物遗传转化,获得转基因APEX拟南芥、棉花材料。为降低内源性生物素、酶类的干扰,对起始反应H2O2处理时间（0 S、3 S、10 S、30 S、60 S）、反应底物生物素酚浓度（0 n M、0.5 n M、5 n M、10 n M、25 n M、50 n M、75 n M）、反应发生器-拟南芥的不同部位（叶、根）及生长阶段（幼叶、成熟叶）、终止处理方式（终止液浸泡、立即液氮后含终止液缓冲液抽提）等变量进行了探究。结果表明,在APEX转基因拟南芥成熟叶片中,最优标记条件为:50 n M生物素酚处理,H2O2起始反应3 S,反应完成后立即液氮速冻,并用含终止液的缓冲液抽提叶片蛋白。在此条件下,可较好完成邻近生物素标记,且WT背景较低。通过该反应条件,间接免疫荧光验证生物素化蛋白位于细胞核,即该条件下,拟南芥中APEX可行使邻近标记功能。同样,在APEX转基因棉花中,也成功完成邻近标记试验。3.拟南芥、棉花-大丽轮枝菌互作相关核蛋白的分离鉴定大丽轮枝菌分别处理APEX转基因拟南芥、棉花叶片4 d和2 d,经邻近生物素标记处理后,利用偶联链霉亲和素的磁珠对生物素化蛋白纯化,LC-MS/MS质谱鉴定样品蛋白。野生型拟南芥生物素标记蛋白质样品命名为AtWT,APEX转基因拟南芥生物素标记蛋白质样品命名为AtAPEX,大丽轮枝菌接种APEX转基因拟南芥后生物素标记蛋白质样品命名为AtAPEX＿Vd。APEX转基因棉花进行相同处理,三组样品分别命名为GhWT,GhAPEX和GhAPEX＿Vd。以检测的肽段数>2为校准线,与拟南芥野生型AtWT相比,AtAPEX检测到228个蛋白,利用Uni Prot KB、NCBI数据库对蛋白进行亚细胞定位分析,其中48个（21.05%）具有细胞核定位信息。接种大丽轮枝菌4天后,AtAPEX＿Vd较AtAPEX以两倍变化量为标准AtAPEX中有152个蛋白表达量发生了显著变化,其中77个蛋白表达上调,75个蛋白下调。差异蛋白主要参与核糖体、TCA循环、催化作用等途径。同样,APEX转基因棉花蛋白组中,GhAPEX＿Vd较GhAPEX分析得到328个表达量差异显著的蛋白,其中,198个蛋白表达下调,130个蛋白表达上调。筛除对照组GhWT中捕获蛋白质,GhAPEX较对照组GhWT中所测得的280个蛋白中,利用Uni Prot KB数据库对蛋白进行亚细胞定位分析,35个蛋白预测在细胞核。4.拟南芥-大丽轮枝菌互作候选核蛋白的筛选及验证通过蛋白组学分析,筛选获得三个差异表达候选核蛋白,分别为At1g07000、At5g22060和At3g54360。在大丽轮枝菌接种拟南芥0-6 d后,候选蛋白的转录水平逐渐上升。利用农杆菌GV3101介导的烟草瞬时表达,表明三个候选蛋白定均位于植物细胞核。烟草瞬时表达At1g07000蛋白后,引起烟草ROS积累,并提高烟草对大丽轮枝菌抗性。我们的研究获得表达APEX的拟南芥及棉花转基因材料,优化了APEX在拟南芥、棉花中优化的生物素标记反应体系,对大丽轮枝菌接菌处理后的生物素标记核蛋白分离纯化后,进行蛋白组学分析,并在拟南芥中筛选出可能参与拟南芥防御调控的候选核蛋白。