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土壤中发生的硝化作用一般被认为是由两类截然不同的微生物所主导的两个连续的步骤,既涉及氨氧化细菌（ammonia-oxidizing bacteria,AOB）和氨氧化古菌（ammonia-oxidizing archaea,AOA）主导的氨氧化过程,也涉及亚硝酸盐氧化细菌（nitrite-oxidizing bacteria,NOB）主导的亚硝酸盐氧化过程。然而在2015年,一种能同时进行氨氧化和亚硝酸盐氧化的微生物被发现——全程氨氧化细菌（Complete ammonia oxidizer,Comammox）,与之相对应,传统的AOA、AOB和NOB被统称为半程硝化微生物。Comammox的发现超越了以往对于硝化过程和硝化微生物的认知,引出了一系列亟待解决的科学问题。虽然目前还没能从土壤生态系统中富集获得Comammox纯培养菌株,但是通过宏基因组和定量PCR的研究结果均发现,Comammox在各种土壤生态系统中普遍存在,说明其很可能在土壤硝化过程中发挥重要作用。现在迫切需要更多的研究以了解Comammox在土壤生态系统中的分布规律及影响因素,确定其是否在土壤生态系统中与半程硝化微生物一起主导硝化作用以及在不同环境条件下对土壤硝化作用的相对贡献。Comammox属于NOB的Nitrospira类群II,也是化能自养型微生物,在土壤中与AOB、AOA和NOB共存,弄清Comammox与半程硝化微生物AOB/AOA以及NOB之间的生态位分化尤为重要,这对揭示土壤中硝化作用的微生物机制有重要意义。基于以上科学问题,我们（1）首先在区域大尺度下沿着纬度梯度选取从南到北的典型森林土壤,研究硝化功能类群随纬度的空间分布格局及驱动因子;（2）为探明不同氮源是否会导致Comammox与半程硝化微生物之间发生生态位分化,选取水稻土和森林土进行氮源实验,研究土壤中硝化作用及硝化微生物对不同氮源的响应;（3）采用13C稳定同位素核酸示踪（DNA-SIP）结合基因测序以充分直接的证据揭示Comammox是否在土壤硝化过程中发挥作用,研究外加氮源和不加氮源的森林土和水稻土的硝化作用和活性硝化微生物群落结构;（4）用氯酸盐抑制剂进行培养实验,以确定不同氮源条件下全程和半程硝化微生物对氯酸盐的响应,评估在土壤中利用选择性抑制剂确定Comammox对硝化作用相对贡献的可行性。获得的主要结果如下:1.区域尺度下森林土壤中硝化功能类群和细菌群落随纬度梯度的分布格局及驱动因子。研究结果发现:AOA和Nitrospira-NOB的丰度一般高于其他硝化功能微生物,所有土壤中都发现了Comammox,其丰度在1.21*106～8.77*106/g干土之间,且Clade A的丰度普遍高于Clade B。AOA、AOB和Nitrobacter与土壤硝化活性有显著相关性,说明这三种微生物可能在森林土壤硝化过程中发挥重要作用。对细菌群落的高通量测序分析发现:跟土壤硝化活性相似,土壤细菌多样性沿纬度梯度呈现先增加后降低的趋势,峰值出现在p H值为中性的中纬度土壤中。土壤中的优势门水平微生物在不同纬度土壤中的占比差异显著。通过限制性主坐标分析（CPCo A）发现土壤硝化功能微生物群落受气候的影响大于土壤细菌群落,根据气候类型分组能分别解释硝化功能微生物群落和细菌群落样品总变异的50.6%和42.7%。通过冗余分析（RDA）发现土壤p H、年降雨MAP和纬度LAT是导致硝化功能微生物类群和细菌群落空间分布的主要驱动因子,硝化功能微生物类群还受年均温MAT的显著影响,这对气候变化情景下土壤硝化微生物多样性和功能的预测具有重要意义。2.森林土和水稻土硝化作用和硝化微生物对不同氮源的响应。研究结果发现:在两种土壤中,氮源的加入均显著促进了土壤硝化作用（P<0.05）,而显著抑制了土壤矿化作用（P<0.05）。有趣的是两种土壤的硝化作用对于不同氮源的响应有明显差异:水稻土中两种氮源处理土壤净硝化速率之间没有显著差异（P>0.05）;然而在森林土中NO2-处理土壤净硝化速率显著低于NH4+处理（P<0.05）。两种土壤中细菌对于不同氮源的响应也有差异,水稻土中微生物多样性对NH4+处理更敏感,而森林土中由于NO2-的大量累积,对微生物产生了毒害导致微生物多样性极显著降低（P<0.001）。定量PCR的结果发现,在不加N的对照处理中,AOA、Comammox Clade B和Nitrospira-NOB的丰度在培养期间显著增加,说明在底物限制环境中,它们可能在土壤硝化过程中发挥重要作用;然而在加N处理中,AOB、Comammox Clade A和Nitrobacter-NOB的丰度在培养期间显著增加,说明它们偏好富营养环境。以上结果暗示不同硝化微生物可能分别在不同营养条件下主导土壤硝化作用,底物有效性是导致硝化微生物类群生态位分化的重要因素。根据以上实验结果,开展了稳定同位素标记试验和选择性抑制剂试验,明确Comammox是否参与土壤硝化过程,探究在不同底物条件下Comammox对土壤硝化作用的相对贡献,得到的主要结果如下:3.通过DNA-SIP以直接的证据揭示土壤硝化过程中的活性功能微生物。结果发现:两种土壤加氮和不加氮处理均发生了硝化作用,且加氮处理土壤净硝化速率显著高于不加氮处理,而加入C2H2能完全抑制土壤硝化作用,说明所有处理中均主要发生与AMO基因相关的自养硝化作用。定量PCR结果表明,Comammox Clade B丰度在森林土壤中比Clade A高,而在水稻土壤中其丰度比Clade A少14倍,说明Comammox两个分支在不同土壤条件下表现出生态位分化特征。在两种土壤中,Comammox Clade B的丰度在不加氮处理中均显著增加（P<0.05）,且同时伴随硝化活性增加。通过比较12CO2和13CO2处理Comammox amo A基因丰度沿Cs Cl梯度的分布发现:在不加氮的森林土和水稻土中,均能发现Comammox Clade B在13C基因组重层中富集,说明Comammox clade B能利用矿化有机氮产生的微量的铵来进行硝化作用,而在高浓度铵存在时,其不具有竞争优势或被抑制。系统发育分析表明,被标记的活性Comammox Clade B的amo A序列被划分到两个OTU,与数据库中两个土壤未培养序列密切相关,被标记的活性AOA和AOB分别主要隶属于Nitrososphaera和Nitrosospira Cluster 3,说明在该培养条件下活性Comammox菌群和半程氨氧化微生物一样,多样性都较低。4.通过氯酸盐抑制剂初探Comammox对土壤硝化作用的相对贡献。结果发现氯酸盐的加入能显著抑制硝化作用,且在不同氮源处理中其抑制效率不同,在NO2-作为氮源的处理中,氯酸盐对硝化作用的抑制效率达到98%,显著高于CK和NH4+处理（约67%）。氯酸盐的加入不影响细菌群落结构和群落多样性,然而对于硝化微生物的丰度和群落结构却有显著影响,且在不同氮源条件下的影响也具有显著差异。氯酸盐处理中AOA丰度在培养前后无显著变化（P>0.05）;而AOB丰度被氯酸盐显著抑制（P<0.05）,而且NO2-氮源处理中AOB的丰度在培养后也显著降低（P<0.05）,说明AOA对NO2-和Cl O3-具有一定的耐受性,而AOB则对NO2-和Cl O3-都不耐受。从AOA和AOB微生物群落的变化也能发现,AOA群落结构相对稳定,而AOB的群落结构在加氮培养后发生显著变化。全程氨氧化细菌两个分支丰度都被高浓度的NO2-抑制,然而Clade A和Clade B对氯酸盐的响应却明显不同。在不加氮源和以铵态氮为氮源的土壤中,添加氯酸盐导致Clade A的丰度显著降低,而Clade B的丰度在培养前后却没有显著差异,说明相较于Clade B,Clade A对于氯酸盐更敏感。氯酸盐的加入显著抑制了NOB的生长,也显著改变了土壤NOB群落结构,但是Nitrobacter-NOB和Nitrospira-NOB对NO2-的响应不同,且不同子类群的NOB对氯酸盐和NO2-的响应也不同。通过计算得到在CK和NH4+处理中Comammox对土壤硝化作用的相对贡献分别为87.04%和58.73%,由于氯酸盐不仅抑制了NOB,还显著抑制了AOB和Comammox Clade A丰度,说明氯酸盐对氨氧化过程也存在抑制,计算得到的相对贡献可能偏高。因此在复杂的土壤系统中,要实现氯酸盐的专性抑制存在一定难度,今后在利用氯酸盐作为专性抑制剂研究微生物对硝化作用的相对贡献时需谨慎。综上所述,区域大尺度上硝化功能类群主要受土壤p H、纬度和气候因子影响,相比于土壤细菌,硝化功能类群受温度的影响更大;不同硝化微生物对氮源和氯酸盐抑制剂存在不同的响应,底物有效性是影响全程与半程硝化微生物生态位分化的重要因子之一;DNA-SIP证实Comammox在贫氮的条件下的确参与了土壤硝化过程,但是其对土壤硝化作用的相对贡献还有待继续研究。