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目的1.分析CRISPR database数据库中金葡菌45个确证CRISPR位点结构特征、重复序列RNA二级结构稳定性,探索该结构的功能特点及影响因素。2.分析间隔序列与质粒或噬菌体同源性、菌株CRISPR型别与多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)型别可能的关联性,探索该结构与金葡菌遗传进化可能的关联。3.利用CRISPR/Cas9系统靶向mecA,从而实现对mecA所在质粒在金葡菌外的特异性清除作用,为进一步探索CRISPR/Cas9系统对金葡菌其他多种耐药基因特异性敲除作用、特异性新抗生素的研制提出新的方法支持。方法1.利用在线数据库 CRISPR database(http://crispr.u-psud.fr/)搜集金葡菌 CRISPR结构基本信息,间隔序列及重复序列分别通过Clustal X软件进行多序列对比、TreeView 1.6.6软件绘制进化树。RNA二级结构使用网络服务器RNA fold Web Server(http://ma.tbi.univie.ac.at/)进行预测。2.使用NCBI BLAST,BLASTP及PUBMED数据库进行DNA及Cas蛋白相似序列查找及菌株MLST型别信息搜索。3.利用PCR扩增mecA基因,凝胶回收、T载体连接、酶切、测序及电转化等方法构建大肠杆菌pET-21a(+)-mecA-C末端质粒,简称pET-21a(+)-mecA质粒。4.利用sgRNAcas9 v2.0软件设计靶向mecA基因的oligos序列,与经内切酶酶切并凝胶回收的载体pCas9连接,成功构建pCas9::mecA-C末端质粒,简称pCas9::mecA 质粒。5.SPSS21.0统计学软件用来比较不同茎部长度的重复序列RNA二级结构稳定性的差异,以及判断靶向mecA不同位点的Cas9质粒对mecA所在质粒作用的差异。结果1.在数据库涉及的含有45个确证CRISPR位点的32株金葡菌中,19株(59.4%)均含有1个确证CRISPR位点,40.6%的菌株基因组中均含有2个确证CRISPR位点。纳入研究的45条重复序列均可以形成保守的哑铃状RNA二级结构,并按照序列相似性,可以归为3大群、15组。第1群中茎部含有5个碱基对的RNA二级结构比含有3个碱基对的结构最小自由能(minimum free energy,MFE)更低。第2群中,茎部较长的二级结构MFE最小。第3群中茎部碱基对数相同,茎部“GC”含量高的二级结构MFE较小。2.在菌株08BA02176和MSHR1132中共5个间隔序列与外源质粒或噬菌体DNA序列具有相似性,其中一条间隔序列与可以编码杀白细胞素的质粒中一段序列完全一致。3.CRISPR位点分17型,归3大群。第1群中,CRISPR型别相同的菌株中绝大多数(≥75.0%)菌株的MLST型也相同。第2群中,2株CRISPR A型菌株均为MLST398型。第3群中,不同CRISPR型别的菌株对应MLST型别也不同。在CRISPR位点周围临近的6个蛋白编码位点中,3个以上与其他CRISPR位点周围相同位置蛋白编码位点序列相似,这些相似蛋白质编码位点所临近的CRISPR位点多数具有相同的CRISPR型别。4.成功构建pET-21a(+)-mecA质粒及pCas9::mecA质粒。在大肠杆菌BL21(D3)中pCas9::mecA可以成功消除pET-21a(+)-mecA,或明显减少其复制。而对照质粒pCas9无此效应。pCas9::mecA及对照PCas9对pET-21a(+)对照质粒均无明显消除作用。结论1.金葡菌中确证CRISPR位点较少。重复序列RNA二级结构茎部碱基数越多,“GC”含量越高者CRISPR能够发挥功能的可能性越大。2.CRISPR位点可能可以在亲缘关系较近的菌种之间转移。菌株08BA02176和MSHR1132中CRISPR位点有可能是继承于同一菌株,或通过外源基因元件的横向转移来源于里昂葡萄球菌,同一 MLST型别的金葡菌可能更容易接受相同型别的外源CRISPR位点。3.pCas9::mecA质粒可以特异性靶向mecA基因,从而造成耐药质粒pET-21a(+)-mecA的消除,或极大程度减少其复制(到凝胶电泳不可见的程度),以限制耐药基因mecA在菌株之间的传播,从而对敏感菌株起到免疫作用。