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目的：制备高特异性、高亲和力的抗表皮生长因子单克隆抗体，制备抗表皮生长因子多克隆抗体，利用商品化的基因重组表皮生长因子标准品及酶标二抗等试剂，建立符合临床检测要求的表皮生长因子ELISA检测方法，并对EGF的临床应用价值作初步探讨。
方法：1、利用已有冻存的EGF杂交瘤细胞株，经复苏传代至细胞生长良好后，ELISA检测上清液抗体的滴度。采用体内诱生法制备单克隆抗体腹水。采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，吸取少量溶液做5或10倍稀释并用紫外分光光度法测定蛋白含量，采用A280nm和A260nm光吸收差法测定，用WesternBlot鉴定单克隆抗体的特异性并测定单抗的亲和常数。
2、以纯化的rhEGF重组蛋白为免疫原免疫新西兰大白兔，获得抗rhEGF多克隆抗体，采用饱和硫酸铵法对抗血清进行纯化，ELISA及WesternBlot方法检测制备的抗血清的效价和特异性。利用商品化的EGF标准品和酶标抗体建立EGF的间接竞争酶联免疫吸附法。
3、以制备的抗EGF单克隆抗体和多克隆抗体，以及商品化的rhEGF标准品和HRP标记的羊抗兔酶标二抗，建立单抗-多抗间接夹心ELISA法检测表皮生长因子。
4、收集慢性肝炎、肝硬化和常见肿瘤(肺癌、肝癌、胃癌和乳腺癌)病人手术前(术前2～3天)及手术后(术后10～15天)的血清样本，同时收集正常体检者的血清样本，用建立的检测方法对所获得的样本进行检测以证实所建方法的可靠性。对EGF检测作为肿瘤辅助诊断及疗效判断指标的价值作初步研究。
结果：1、冻存的EGF杂交瘤细胞株复苏传代经培养扩增后采用腹水诱生法制备了大量单克隆抗体，经辛酸-饱和硫酸铵法纯化单克隆抗体，抗体的蛋白含量为6.50mg/ml，SDS-PAGE鉴定纯度可达90％以上，WesternBlot鉴定McAb具有良好的特异性；间接ELISA检测McAb的腹水效价为2×10-6，亲和常数为2.4×10-10mol/L。
2、获得的抗EGF多抗血清用ELISA方法检测，抗体效价达到1∶32000，WesternBlot鉴定表明该抗体可有效识别商品化的rhEGF蛋白。以rhEGF为包被抗原，表皮生长因子为竞争的抗原，两者与一定量的抗EGF多抗反应。实验结果表明，理想的包被抗原浓度为1μg/ml，抗EGF多抗工作浓度为1∶100000，酶标二抗工作浓度为1∶8000，可测最适范围为0.5ng/ml-32ng/ml，标准曲线的批内和批间变异系数分别为1.63％和4.36％。得到回归方程y=-0.1281Ln(x)+0.8116，相关系数r2=0.9938。
3、应用获得的抗rhEGF单克隆抗体和多克隆抗体，建立表皮生长因子的单抗-多抗间接夹心ELISA检测法。该法的最适可测范围为0.125～8ng/ml，回归方程为y=0.8056x-0.2987，相关系数R2=0.9971，批内变异系数4.75％～7.50％，批间变异系数为7.49％～12.92％，回收率为91.4％～95.2％。质控品检测的相对误差＜10％，相对标准差(RSD)＜15％。
4、应用建立的单抗-多抗间接夹心ELISA法对62例正常人，37例肺癌患者，42例肝癌患者，36例乳腺癌患者及28例胃癌患者术前、术后的血清EGF检测结果分别为(ng/ml)1.26±0.38，(1.87±0.52，1.43±0.44)，(0.66±0.32，1.09±0.38)，(0.98±0.37，1.29±0.35)，(1.39±0.49，1.24±0.45)。实验结果表明，肺癌患者血清中EGF含量高于正常人，术后血清EGF水平有明显的下降；然而，肝癌患者和乳腺癌患者血清EGF含量低于正常人，术后血清EGF水平有明显的上升。胃癌患者血清中EGF含量与正常人相比没有明显的变化。慢性肝炎患者(51例)和肝硬化患者(47例)血清EGF浓度分别为1.07±0.37、0.85±0.35ng/ml，相比正常人均有明显的降低。
结论：1、成功制备了抗EGF的多克隆抗体，该抗体的效价达1∶32000，经饱和硫酸铵分级沉淀后的抗体经SDS-PAGE鉴定有较高的纯度，蛋白含量为9.17mg/ml，由该抗体建立的间接竞争ELISA检测法有较高的敏感性且成本较低，适于EGF含量稍高的临床尿液或细胞培养上清液的检测。
2、成功制备了抗EGF单克隆抗体，该抗体的效价达2×10-6，亲和常数为2.4×10-10，经辛酸-硫酸铵纯化后抗体的纯度达90％以上，Westernblot鉴定有良好的特异性。由此抗体及多抗建立的单抗-多抗夹心ELISA法有较高的敏感度及较宽的线性范围(0.125～8ng/ml)，已满足对临床血清样本EGF的检测。对该方法的批内批间变异系数、回收率及线性评价表明该方法有很好的准确度及可靠性；对质控品的检测表明制备的质控品有较好的稳定性。实验结果表明，单抗-多抗间接夹心ELISA方法可初步应用于临床检测人血清中EGF的含量，为深入研究血清(或其它体液EGF水平)与肿瘤患者(或其它疾病)的疗效及预后判断之间的关系提供方法基础。
3、对各肝病组EGF水平的检测表明，对照组水平＞慢性肝炎组水平＞肝炎后肝硬化水平＞原发性肝癌组水平，提示EGF水平随肝细胞受损程度的加重而逐渐降低。因此，血清EGF水平可作为衡量肝病病情变化的重要指标。本实验研究可见肺癌患者血清EGF水平较正常人有显著增高，手术切除肺癌组织后血清EGF下降明显，推测肺内癌组织中的EGF水平可能是血清中EGF的重要来源。肺癌患者血清中EGF含量与疗效、预后判断的关系值得进一步研究。胃癌患者血清中EGF水平与正常人无显著性差别，血清EGF用于胃癌的诊断及预后判断意义需作进一步探讨。乳腺癌患者血清EGF水平较正常人有显著的下降，其下降的机制及与疗效、预后判断的意义也需进一步研究。