第一部分载ACE2激动剂靶向胶原纳米粒的制备及安全性研究目的:制备表面连接胶原结合蛋白（CNA35）,并载有ACE2激动剂-三氮脒（Diminazene aceturate,DIZE）,金纳米棒（Gold nanorods,GNR）和全氟正戊烷（PFP）的脂质体纳米粒（CNA35-GNR/DIZE/PFP@NPs,CNA35-GDP@NPs）,检测其表征并评价生物安全性。方法:采用真空旋转蒸发法联合二次声振法制备载药多模态显像的纳米粒（GNR/DIZE/PFP@NPs,GDP@NPs）,采用碳二亚胺法在纳米粒表面连接CNA35得到多功能靶向载药纳米粒（CNA35-GDP@NPs）。观察外观、粒径、电位、CNA35连接率等表征,优化制备过程,得到药物最佳包封率和载药量,并评价纳米粒的稳定性、体外释药特点。采用CCK8实验评价不同浓度梯度的CNA35-GDP@NPs纳米粒（0.75~6mg/ml）,1mg/ml GNR和5mg/ml PFP@NPs与SD大鼠的原代心脏成纤维细胞共孵育24h后的细胞活性。取健康成年SD大鼠6只,随机分为2组（n=3）,经尾静脉注射纳米粒悬液1ml（浓度6mg/ml）,对照组注射等量PBS,1h、24h、48h后经尾静脉采血送检血常规、肝肾功能及心肌酶,最后取大鼠心、肺、肝、脾、肾重要器官做HE染色行病理检查。结果:制备的载药靶向纳米粒CNA35-GDP@NPs在光镜下呈点状,分散度好;透射电镜观察纳米粒呈类球形。Malvern粒径仪器测得平均粒径为（311.38±4.5）nm,平均电位（-38.15±0.32）m V。流式细胞仪检测CNA35与纳米粒的连接率为（82.97±4.19）%。所制备的纳米粒在4℃的温度下放置2周粒径无明显变化。ICP法测得包裹GNR最佳的载药量为2.63±0.06%。高效液相色谱法测得纳米粒中DIZE的包封率为（21.7±3.8）%,载药量为（3.30±0.60）%,体外药物释放实验显示纳米粒在48h内药物自然释放速率较快,后达到平台期缓慢释放,1周药物释放量约为50%,而在LIFU激发作用下能够快速释放达96.9%以上的药物。CCK8实验结果显示,原代心脏成纤维细胞在与0.75~6mg/m L浓度范围内的纳米粒孵育24h后,细胞活性仍有87.4±12.4%及以上,与组成纳米粒的主要成分GNR和PFP@NPs孵育后细胞活性分别为91.3±5.0%和93.9±14.1%。6mg/ml浓度纳米粒注入体内后,大鼠的血常规、肝肾功能及心肌酶等指标与对照组差异无统计学意义（p＞0.05）,HE染色显示心、肺、肝、脾和肾与对照组无明显变化。结论:成功制备了靶向胶原载药多功能纳米粒CNA35-GDP@NPs,其形态一致,大小均匀,结构稳定,具有良好的生物安全性。第二部分载ACE2激动剂靶向胶原纳米粒CNA35-GDP@NPs的靶向性研究目的:建立SD大鼠心肌纤维化的动物模型,评价制备的靶向多功能载药纳米粒（CNA35-GDP@NPs）在体外、体内环境中靶向心脏纤维化区域胶原的能力。方法:通过手术结扎健康成年SD大鼠左冠状动脉前降支致急性心肌梗死,术后继续观察喂养4周,待梗死中心区域及边缘区形成局部纤维化。在上述过程中,术前、术后2h内对比心电图变化,术后1周查超声心动图,评价冠脉结扎后心肌梗死程度及位置。术后4周取动物心脏,行病理切片做Masson染色、天狼星红染色（PSR）和FITC-CNA35免疫荧光染色评价大鼠心肌纤维化。体外靶向实验:取上述所得心肌纤维化大鼠的心脏标本,沿左心室短轴,取心肌纤维化及周围区域心肌组织做冰冻切片,所得切片随机分为2组,分别用带Di I和FITC荧光染料的靶向纳米粒和带Di I的非靶向纳米粒染色冰冻切片,DAPI染色细胞核,在激光共聚焦显微镜下观察心肌纤维化区域纳米粒聚集情况。体内靶向实验:取心肌纤维化的大鼠12只,随机分为2组,经尾静脉注射等量的带Di I和FITC的靶向纳米粒和带Di I的非靶向纳米粒,注射后30min,每组随机选择3只大鼠,取心肌纤维化及周围区域心肌组织并固定,行病理切片做Masson染色,进行心肌纤维化胶原面积评价,同时取切片,DAPI染色细胞核后,对比两种纳米粒聚集部位,及荧光染料阳性表达区域的平均荧光强度;剩余每组3只大鼠,同样取心肌纤维化及周围区域心肌组织行冰冻切片,DAPI染色细胞核,在激光共聚焦显微镜下观察心肌纤维化区域纳米粒的富集情况。结果:在结扎大鼠左冠状动脉前降支后,术后心电图显示胸前导联ST段抬高,术后1周检查心脏超声显示左心室前壁/侧壁变薄,与术前对比,术后心脏EF值降低（74.00±3.90%vs 46.67±3.56%,P＜0.01）,FS值降低（57.17±4.45%vs 20.17±1.72%,p＜0.01）。术后4周行Masson,PSR病理染色显示大鼠心脏左室前壁/侧壁局部明显纤维化,共聚焦显微镜下可见,带有FITC的CNA35蛋白呈绿色荧光,并且明显地聚集在心肌纤维化胶原增生区域,证明CNA35对纤维化区域的胶原纤维有良好的靶向性。体外纳米粒的靶向实验结果显示,带有Di I和FITC荧光的靶向纳米粒聚集在心肌纤维化区域,证明通过碳二亚胺法将CNA35连接于纳米粒表面后,CNA35蛋白仍然具有靶向胶原纤维的能力。体内靶向实验结果显示,经大鼠尾静脉注射的靶向纳米粒,通过血液循环后可以靶向聚集在心肌纤维化区域（对比Masson染色阳性区域）,并且在纤维化程度相近的条件下（Masson胶原染色面积无差异,p＞0.05）,靶向纳米粒组切片的平均荧光强度明显高于非靶向组（161.12±26.40 vs28.39±7.62,p＜0.01）。体内靶向冰冻切片结果显示在心肌纤维化区域,靶向纳米粒定位在带蓝色荧光的细胞核周围,并且其携带的FITC绿色荧光和Di I红色荧光融合良好。结论:通过离体及活体实验,证实制备的CNA35-GDP@NPs纳米粒具有较好的靶向心肌纤维化的能力。第三部分载ACE2激动剂胶原靶向纳米粒CNA35-GDP@NPs的多模态显像研究目的:观察CNA35-GDP@NPs经大鼠尾静脉注射进入体内后在脏器分布情况;评估纳米粒体外的超声（US）/光声（PA）/CT成像能力;观察在心肌纤维化大鼠模型中,制备的靶向纳米粒在体内US/PA/CT多模态显像心肌纤维化的能力。方法:1.体内荧光成像评估纳米粒的体内分布:心肌纤维化的SD大鼠随机分为靶向组和非靶向组,每组16只,分别经尾静脉注射1ml的带Di R的靶向和非靶向纳米粒,在注射药物前、30min、1h、1.5h、2h、4h、6h、24h时间点各处死2只动物,取心脏、肺、肝、脾、肾脏器,行荧光显像,并测量信号强度。2.体外超声成像:取纳米粒悬液1ml,分3组加入到琼脂糖凝胶模具中,采用不同功率（1W/cm2~3W/cm2）的低功率聚焦超声仪（LIFU）辐照,作用时间为1~5min,用超声诊断仪进行B模式和造影模式（CEUS）超声成像。体内超声成像:心肌纤维化的SD大鼠随机分为2组,每组5只,分别经尾静脉注射等浓度的靶向或非靶向纳米粒悬液各1ml,采集注射前、注射30min后的心脏左室短轴切面超声图像,并采用LIFU辐照仪以2W/cm2在心前区辐照4min后,再次采集短轴切面的超声图像进行对比。3.体外光声成像:重悬后的纳米粒悬液200ul,加入到凝胶模型中,用小动物光声仪,在激发波长680nm至970nm的范围内进行连续性光声成像（步长=5nm）,获得体外纳米粒的PA显像图像,并从中选择显像最佳的作用波长。取不同浓度范围的纳米粒稀释液（0.375~6mg/ml）,加入到凝胶模型中,选择上述所得最佳波长作用后观察光声成像,并采集光声信号强度值。体内光声成像:取心肌纤维化的SD大鼠随机分为2组,每组5只,在有创呼吸机支持下,充分暴露心脏,经尾静脉注射等量的靶向和非靶向纳米粒,分别于注射前、注射后1h、1.5h、2h、4h时间点采集光声成像图片,观察光声成像最佳的时间。取不同心肌纤维化大鼠,进行光声成像,并与心肌组织的Masson病理染色对比。4.体外CT成像:取纳米粒悬液按照所含GNR浓度为87.5ug/ml~1000ug/ml进行稀释,并分别加入到1.5ml的EP管中,进行体外CT显像,并测量CT值。同时配置等浓度梯度碘海醇溶液作为对照组。体内CT成像:心肌纤维化的SD大鼠随机分为2组,每组5只,经尾静脉注射等量的靶向与非靶向的纳米粒,分别于注射前、1h、1.5h、2h、4h时间点采集CT成像图片,采用3D Slicer软件从横断位、矢状切面观察心脏CT成像效果,并比较CT值变化。结果:1.体内荧光成像显示与非靶向组相比,靶向纳米粒进入体内后,可以定位聚集在心脏纤维化区域,并且在1.5h时间点,荧光强度达到峰值,明显强于非靶向纳米粒组[（13.11±4.22）×106 vs（1.15±0.31）×106,p＜0.01],而在肺、肝、脾、肾的荧光强度对比无差异（p＞0.05）;2.体外超声成像:通过对比不同功率及辐照时间的LIFU作用后超声成像图及灰度值,得出在2W/cm2,4min的LIFU辐照条件下,纳米粒可获得最佳超声增强显像。体内超声成像实验:在注射靶向纳米粒30min后,采集的超声成像并未见明显的增强显像结果,在2W/cm2,4min的LIFU仪作用下,超声成像仪采集到心室壁变薄区域的超声显影增强,而非靶向组未见明显的增强显影;3.体外光声显像:在不同波长的光声成像结果中,715nm波长激发下,纳米粒光声成像效果最佳,选择此波长值作为后续成像的激发波长。随着纳米粒浓度的增加,光声成像信号强度增加,具有良好的相关性。体内光声成像:经尾静脉注射靶向纳米粒悬液后1.5h,在心脏纤维化区域可见增强的的光声信号。纤维化范围越广,PA成像越明显。4.体外CT成像:随着纳米粒浓度增加,CT值呈良好的正相关,并且对比碘造影剂有较高的CT值（p＜0.001）。体内CT成像:经尾静脉注射靶向纳米粒1.5h后,与非靶向纳米粒组对比,心肌纤维化区域可见增强的CT信号（141±5.13 vs 108±1.53,p＜0.001）。结论:制备的靶向胶原多功能纳米粒可以实现大鼠心肌纤维化区域的US/PA/CT的多模态显像。