目的:脑胶质瘤是起源于神经胶质细胞的最常见的原发性颅内肿瘤,在我国,脑胶质瘤年发病率为5.8/10万。世界卫生组织（WHO）将脑胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级,其中Ⅰ、Ⅱ级为低级别脑胶质瘤,预后较好,而以胶质母细胞瘤（GBM）为代表的Ⅳ级胶质瘤恶性程度最高,5年生存率不足6%。近年来,脑胶质瘤的诊断已经进入到分子时代,除了传统的组织学检测,分子亚型的检测日益受到人们的重视。如异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）启动子区甲基化、α地中海贫血伴智力低下综合征X连锁基因（ATRX）突变、端粒酶逆转录酶（TERT）启动子突变等分子病理学特征,对脑胶质瘤的个体化治疗及预后判断具有重要意义。但是由于脑胶质瘤具有高度基因异质性,脑胶质瘤,特别是以GBM为代表的高级别胶质瘤的治疗仍然是一个挑战,需要继续寻找更敏感的标志物和更有效的治疗靶点。核不均一核糖核蛋白F（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F,hnRNP F）是一种具有RNA结合能力的蛋白,有研究表明,该蛋白广泛参与调节选择性剪接、前体mRNA加工、mRNA转录和翻译调节以及维持端粒稳定性等多方面功能,因此在癌症的发生和发展过程中都发挥重要作用。但是目前该蛋白与脑胶质瘤致病机制的关系尚不明确。本文研究尝试探索hnRNP F在人脑胶质瘤中的表达情况,并进一步挖掘其对肿瘤细胞生物行为学的影响及其内在机制。研究方法:1、利用TCGA和CGGA数据库中GBM及LGG的高通量测序数据进行生物信息学分析,探索hnRNP F的编码基因HNRNPF在不同级别和不同组织类型的胶质瘤中的表达差异情况,并分析其表达量与患者总体生存时间的关系。2、使用临床样本及胶质瘤细胞系,验证hnRNP F蛋白的表达情况。3、构建沉默和过表达hnRNP F的慢病毒,建立稳定转染的细胞系。4、采用CCK-8法、Ed U法、细胞集落实验、细胞划痕实验、基质胶侵袭实验测定沉默及过表达hnRNP F之后的胶质瘤细胞的增殖、迁移以及侵袭能力的变化。5、采用ELISA法测定VEGF以及血管生成实验,测定沉默及过表达hnRNP F之后的胶质瘤细胞的促血管生成能力。6、采用western blot检测沉默及过表达hnRNP F之后的胶质瘤细胞中,hnRNP F蛋白表达的变化情况以及上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）相关蛋白的表达情况。7、使用沉默hnRNP F的胶质瘤细胞系,做转录组测序及RNA免疫沉淀与高通量测序（RNA immunoprecipitation and high throughput sequencing RIP-seq）,寻找hnRNP F蛋白结合并且参与调控的mRNA,并探索hnRNP F蛋白调控的下游通路。8、根据分析结果,验证PI3K-Akt通路的分子标志物的变化,并使用PI3K-Akt通路特异性抑制剂LY294002以及THBS2过表达质粒,验证hnRNP F蛋白是否通过调控THBS2的表达进而影响PI3K-Akt通路,从而发挥致癌作用。9、通过裸鼠皮下成瘤实验,以检测沉默或过表达hnRNP F后,肿瘤细胞在体内成瘤的能力变化。并取肿瘤标本,做免疫组化分析,探索肿瘤组织中hnRNP F、EMT相关指标、Ki-67等等的变化情况。10、联合分析转录组测序及RIP-seq的结果,寻找hnRNP F蛋白可能参与的可变剪切事件,并通过q PCR验证不同剪切异构体的表达情况。11、各项实验均独立重复3次以上,使用Graphpad Prism 8.0进行作图和统计,采用t检验进行组间比较,P＜0.05被认为有显著的统计学差异。结果:1、对TCGA、CGGA数据库中的脑胶质瘤测序数据进行生物信息学分析,结果显示Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤中HNRNPF基因表达量较低,Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤表达量较高;按组织类型来看,少突星形细胞瘤中表达量较低,而GBM中表达量最高;而如果根据IDH和1p19q共缺失状态来分组,IDH突变型中表达量较低,IDH野生型及1p19q未缺失组的表达量最高。2、对临床样本的石蜡切片进行免疫组化研究,结果显示在GBM中,hnRNP F的表达量较高;同样在细胞系中,我们发现hnRNP F的表达量在高级别胶质瘤细胞系中表达最高,在低级别胶质瘤细胞系和正常细胞系中表达量较低。3、CCK-8细胞增殖实验、Ed U细胞增殖实验、克隆形成实验、裸鼠皮下成瘤实验、划痕实验、基质胶侵袭实验等证实,过表达hnRNP F后,U87细胞系细胞增殖、迁移、侵袭的能力增强,沉默hnRNP F后A172、U251细胞系的增殖、迁移、侵袭能力降低。4、ELISA法测定培养基VEGF浓度,结果显示沉默hnRNP F后U251细胞的培养基中,VEGF的浓度降低,过表达hnRNP F的U87细胞培养基VEGF浓度增高;血管生成实验显示,沉默hnRNP F后U251细胞的血管促血管生成能力降低,过表达hnRNP F后U87细胞促血管生成能力增强。5、经western blot实验发现,vimentin、MMP-2、N-cadherin、E-cadherin等EMT相关分子标志物有明显改变,这说明hnRNP F参与调控上皮间充质转化过程。6、沉默hnRNP F后行转录组测序,发现沉默hnRNP F后,上调的基因216个,下调基因52个,下调基因富集于PI3K-Akt信号通路。行RIP-seq实验,得到与hnRNP F结合的基因10193个,与hnRNP F结合并且转录水平随之降低的基因仅有30个,其中包括PI3K-Akt的上游分子THBS2的编码基因。由此我们推测,hnRNP F与编码THBS2的mRNA结合并调控其表达,进而通过下游的PI3K-Akt通路调控胶质瘤细胞的生物学行为。7、经western blot实验证实,沉默hnRNP F后U251细胞中PI3K和磷酸化AKT的表达降低,而过表达hnRNP F的U87细胞中PI3K和磷酸化AKT的表达升高。加入PI3K-Akt通路的特异性抑制剂LY294002后,可抑制hnRNP F过表达所导致的上皮间充质转化、细胞增殖能力增强、细胞侵袭及迁移能力增强。经PCR测定,沉默hnRNP F后,THBS2的mRNA转录水平明显降低,而过表达hnRNP F后THBS2的mRNA转录水平增高。对沉默hnRNP F的U251细胞转染THBS2质粒之后,可回复其对PI3K-Akt通路及EMT指标的抑制作用。8、裸鼠皮下成瘤实验同样证实,沉默hnRNP F使U251成瘤能力降低,过表达hnRNP F使U87细胞成瘤能力增强。取皮下成瘤的肿瘤组织,做免疫组化,结果显示过表达hnRNP F后,E-cadherin表达降低,N-cadherin表达增高,进一步证实hnRNP F可促进上皮间充质转化。结论:1、hnRNP F在人脑胶质瘤组织中高表达并与肿瘤恶性程度正相关,其表达量越高,患者预后越差;2、hnRNP F能促进人脑胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT以及血管生成;3、hnRNP F能通过激活PI3K-Akt信号通路促进人脑胶质瘤细胞的增殖、迁移和EMT过程;4、hnRNP F可与THBS2的mRNA结合,调控其表达,进而调控下游PI3K-Akt通路。