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背景介绍:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性、小关节对称的炎症性为主的全身性的自身免疫性疾病,是导致我国人口残疾的第二大原因。此外,虽然甲氨蝶呤等改善病情的抗风湿药能缓解病情,却无法彻底根治,而且有严重的副作用。目前RA已成为危害人类健康的重要疾病之一,但其病因尚不清楚。RA被认为与细菌感染密切相关,但其作用机制不明确。2015年7月,北京协和医院和华大基因等机构的研究人员共同合作完成了RA患者口腔和肠道微生物元基因组研究发现口腔和肠道菌群变化是病理生理和疾控的重要环节。发表在《自然》杂志。但是这些口腔和肠道菌群参与RA的具体机制不明确。2020年3月11日,加州大学圣地亚哥分校医学院研究人员开发了一种新颖的方法,可以通过简单地分析血液中存在的微生物DNA的模式来识别癌症,发表在《自然》杂志。RA的血和滑液是否存在微生物DNA不明确。我们前期研究证明RA的肠道菌群失衡,并发现普雷沃氏菌(Prevotella copri)、牙龈卟啉单胞菌、拟杆菌等显著表达失衡。但是菌群如何参与RA的具体发病机制均不清楚。为了能够深入研究参与RA的机制,我们采用大量临床样本和选择了RA滑膜成纤维细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)和胶原诱导性关节炎(Collagen induced arthritis,CIA)模型,有利于研究肠道菌群在关节炎发病中的作用机制。目的:本课题组使用二代测序技术比较RA、骨关节炎(Osteoarthritis,OA)和健康组的肠道菌群差异,寻找在RA中起关键作用的菌群。对滑膜液进行非靶向代谢组学筛选参与RA病变的微生物代谢物。然后分别对RA血液、粪便和滑液中的拟杆菌、牙龈卟啉单胞菌和普雷沃氏菌建立PCR定量分析,分析菌群在不同部位的精准定量,为辅助早期诊断RA提供科学的实验依据。选择两种公认的并在RA肠道中减少的益生菌混合在一起制作益生菌制剂进行干预实验,研究益生菌群改善或缓解RA,阐述菌群在RA中的作用机制和探讨益生菌制剂辅助治疗RA的疗效极为迫切。第一部分RA中微生物组及代谢物特征的分析及定量内容:选取85例RA、21例骨关节炎(Osteoarthritis,OA)和43例健康组粪便样本,男女比例31﹕118,年龄20-80岁之间。对其粪便样本进行宏基因组测序和滑膜和滑膜液样本进行16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S r RNA)V1-V2结构域进行测序分析菌群特征,筛选出潜在的菌群生物标志物;对潜在的菌群生物标志物与临床免疫因子(IL-1α、IL-1β、TNF-α、LI-17和IL-6)之间进行关联性分析;并预测菌群的功能基因组成。使用非靶向代谢组学技术检测滑膜液中微生物代谢产物,通过通路分析参与RA发病的作用机制。并对筛选出的普雷沃氏菌等PCR定量验证。结果:通过对肠道和滑膜进行测序分析,确定RA菌群失衡。LEf Se鉴定出了可鉴别的特征(LDA score>2,α<0.05),其相对丰度在RA中有显著差异。其中人体普氏菌(Prevotella copri)在RA的肠道富集,同时其核酸存在RA的滑膜液中。通过代谢组学分析得出微生物代谢物如短链脂肪酸的丁酸和丙酸、胆汁酸等均参与RA的病变机制。通过定量得出普雷沃氏菌属在RA患者的粪便中的含量为1.98ng/μl。拟杆菌在RA患者的粪便中含量显著减少,为0.06 ng/μl。结论:本研究从源头-肠道、病灶-滑膜组织及滑膜液入手解释了RA中微生物群落失衡,刺激黏膜表面免疫系统,其代谢产物参与RA的作用机制。根据不同部位普雷沃氏菌的绝对定量结果,推测普雷沃氏菌可能作为致病菌参与RA的病变过程中。拟杆菌作为有益菌存在健康人的样本中,在RA患者的样本中减少,有可能是因为RA的肠道菌群结构发生变化,导致菌群失衡。因为这些菌DNA在RA样本中都有检测到,可以作为辅助早期诊断RA的指标提供有利的证据。第二部分:益生菌干预RA滑膜成纤维细胞(RA FLS)的作用机制初步研究内容:从菌株公司购买乳酸杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)混合成益生菌制剂。采用这个混合的益生菌群进行干预RA FLS,步骤包括:滑膜细胞原代培养、滑膜细胞传代培养、采用MTS法检测细胞增殖能力、采用划痕法检测细胞迁移能力、采用Transwell法检测细胞侵袭能力和酶联免疫吸附测定试剂盒(Enzyme—linked immunosorbent assay,ELISA)检测炎性因子的表达差异。初步探讨益生菌群干预RA FLS的作用机制。结果:采用益生菌制剂进行干预RA FLS发现,采用梯度稀释法进行干预发现最佳的干预浓度是800 pg/μl。对滑膜成纤维细胞进行原代培养,3代后方可进行后续实验,通过益生菌制剂直接干预滑膜成纤维细胞24小时后采用MTS法检测发现益生菌影响了滑膜成纤维细胞的增殖能力;采用划痕法检测细胞迁移能力发现益生菌有阻碍滑膜成纤维细胞迁移的趋势;采用Transwell法检测滑膜成纤维细胞侵袭能力发现细胞数目也有显著差异,会阻碍RA FLS的侵袭能力;ELISA检测IL-17、IL-6和IL-1的表达发现IL-17有显著差异(P<0.05)。结论:益生菌对RA FLS的慢性炎症具有保护作用。益生菌制剂显著缓解RA FLS的增殖、迁移和侵袭能力,为临床上使用益生菌制剂改善RA症状提供新思路。第三部分:益生菌干预胶原诱导性关节炎小鼠的肠道菌群特征及机制研究内容:益生菌制剂灌胃DBA/1小鼠,从初次免疫前2周开始灌胃,持续6周。记录关节炎评分,分析胶原干预组(Collagen intervene)、对照组(Control)、胶原组(Collagen)、胶原抵抗组(Collagen resistance)四组的肠道菌群的变化,小鼠电子计算机X射线断层扫描技术(Computed tomography,CT)检测模型组小鼠骨骼侵蚀的情况,苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察小鼠关节滑膜空间结构的变化,ELISA检测小鼠血清中IL-17、IL-6和IL-1炎性因子的变化情况。研究益生菌干预是否改善RA病症,进一步诠释菌群在RA中的作用机制。结果:用益生菌制剂灌胃胶原干预组(Collagen intervene),对照组包括完全对照组(Control)、胶原组(Collagen)、胶原抵抗组(Collagen resistance)三组,每组小鼠6只,CT显示用益生菌干预的胶原干预组的小鼠的骨骼破坏度轻,HE染色观察小鼠的关节滑膜没有明显的结构变化,ELISA检测小鼠血清中IL-17、IL-6和IL-1的表达发现胶原干预组有缓解炎性因子的趋势,但是无显著性差异,小鼠的肠道菌群结构变化显著。结论:目前,肠道菌群研究给诸多疾病的研究提供了一个非常好的切入点,然而对有关参与RA和OA发病机制的微生物研究还不够深入,从而阻碍了对其更具有效性及特异性的治疗方法的探索。随着分子生物学技术和手段的不断发展,使我们能够更深入的认识微生物与RA的关系,从而为RA的治疗提供广阔前景。基于以上科学问题和以往的工作基础,肠道菌群引起RA发生发展的可能机制:微生物可通过分子模拟机制调节免疫T细胞的分化,诱导产生IL-17等多种炎症细胞及炎性因子,攻击滑膜及软骨组织,改变黏膜通透性,破坏黏膜屏障及免疫功能,导致RA自身免疫病。我们提出假说:基于“菌-肠-关节轴”对话,肠道菌群及其代谢产物刺激黏膜免疫紊乱,破坏了自身免疫耐受,产生自身抗体进而导致T细胞亚群失衡及炎症性细胞因子的释放,通过级联放大的瀑布效应,最终诱导类风湿关节炎的发病。