第一部分EST3对tmTNF-a杀伤功能的影响及机制的初探肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）作为一种多功能的细胞因子,具有广泛的生物学效应,可参与细胞增殖、分化,杀伤肿瘤细胞,发挥免疫调节作用等；还可作为炎症介质参与发热、慢性感染。TNF-α以两种生物活性形式存在,即17kDa的分泌型TNF-α（secreted TNF-a, sTNF-α）和26kDa的跨膜型TNF-α（transmembrane TNF-α, tmTNF-α）。tmTNF-α是sTNF-α的前体,主要表达在活化的单核细胞和免疫细胞表面。细胞膜表面的tmTNF-α在TNF转化酶（TACE/ADAM17）的作用下,被剪切释放出sTNF-α。本课题组前期工作证实两型TNF-α的杀瘤效应存在明显差异,即两型TNF均与TNFR结合发挥效应,但诱导同一靶细胞死亡的方式却明显不同,tmTNF-α主要诱导细胞凋亡,sTNF-α主要诱导细胞坏死。进一步利用抑制性消减杂交技术,获得两型TNF-α激活的差异表达基因片段即tmTNF-α特有的功能相关基因EST3 （GenBank登录号AW675924）。经与Blast比对,确认EST3属S2核糖体蛋白家族分子。但是,该分子对tmTNF-α生物学功能的影响和机制尚不清楚。本研究构建正反向EST3及其突变体,初步探讨EST3及其重要功能域对tmTNF-α杀瘤功能的影响及其分子机制。主要研究结果如下：一. EST3及EST3突变体重组质粒的构建与鉴定：利用RT-PCR和重叠PCR技术,成功构建EST3-pIRES2-GFP（野生型EST3）、△59-91-EST3-pIRES2-GFP（缺失缺失了核糖体蛋白S5标记位点）、△42-105-EST3-pIRES2-GFP（缺失S5双链mRNA结合域）和△16-22-EST3-pIRES2-GFP（缺失酪氨酸激酶磷酸化位点）突变体,经菌落PCR、酶切及测序鉴定确认除预期突变外,无任何其它点突变,移码及缺失突变。二. EST3在真核细胞中的定位：将pTriEx-EST3-EGFP融合表达质粒转染HepG2细胞,用PI复染胞核,结果显示：EST3分布于细胞浆和细胞核中。三.化疗药物杀伤HepG2和K562细胞模型的建立：采用MTT法检测不同浓度的顺铂（CDDP）对HepG2和K562细胞的胞毒作用,其IC50分别为15μg/ml和13μg/ml,提示上述两种细胞株对CDDP中度敏感,故选取顺铂为本研究的化疗药物杀伤模型。四.高表达EST3可增强tmTNF-α和CDDP对HepG2细胞的杀伤：1.EST3重组质粒在HepG2细胞中的表达：前期工作提示HepG2细胞EST3含量少,且对tmTNF-α杀伤敏感性较小。故本研究将pTriEx-EST3-EGFP转染HepG2细胞,观察能否提高靶细胞对凋亡的敏感性。经Western blot鉴定转染EST3在32kD处有特异性条带,与未转染组相比明显加深,提示EST3成功表达。2.高表达EST3可促进tmTNF-α和CDDP介导的胞毒效应：MTT法结果显示：与对照组相比,tmTNF-α和CDDP对转染EST3正向重组体的HepG2细胞的杀伤效应明显提高（约上升20%）,提示EST3能提高HepG2靶细胞对tmTNF-α和CDDP杀伤的敏感性。3.高表达EST3可促进tmTNF-α和CDDP介导的细胞凋亡：用Hoechst染色结果显示：与对照组相比,高表达EST3可明显促进tmTNF-α和CDDP诱导的HepG2细胞凋亡,其细胞核呈现染色质浓缩、变形、断裂的荧光碎片。该结果提示高表达EST3能提高HepG2细胞对凋亡的敏感性。4.高表达EST3可促进tmTNF-α和CDDP介导的G1细胞发生凋亡：流式细胞术结果显示：在tmTNF-α和CDDP作用下,与对照组相比,高表达EST3的HepG2细胞出现的亚G1峰明显增高,同时G1期的细胞明显减少（约30%）,提示EST3可促进tmTNF-α和CDDP介导的HepG2细胞在G1期发生凋亡。五.抑制EST3表达可降低tmTNF-α和CDDP对K562细胞的杀伤：1.EST3反向质粒在K562细胞中的表达：前期工作提示K562细胞EST3含量较高,且对tmTNF-α杀伤敏感性较大。故本研究将EST3反向质粒pTriEx-EST3（-）转染K562细胞后,抑制其组成性表达,观察能否降低靶细胞对凋亡的敏感性。经Western blot鉴定EST3在32kD处特异性条带明显减弱,提示EST3表达成功下调。2.抑制EST3可降低tmTNF-α和CDDP对K562细胞的杀伤：MTT结果显示：转染EST反向质粒,可明显抑制tmTNF-α和CDDP对K562细胞的杀伤作用,其杀伤率分别降低了29%和31%。提示抑制EST3的表达能降低K562细胞对tmTNF-α和CDDP杀伤的敏感性。六.EST3功能域与其提高靶细胞对tmTNF-α和CDDP杀伤敏感性的关系：1.转染EST3及其突变体对tmTNF-α和CDDP杀伤HepG2的影响：分别用wtEST3.Δ16-22-EST3突变体、Δ59-91-EST3和Δ42-105-EST3转染HepG2细胞,观察对tmTNF-α和CDDP杀伤的影响。结果显示：与对照组相比,tmTNF-α和CDDP对转染wtEST3或Δ16-22-EST3突变体的HepG2细胞杀伤效率明显提高（分别为13.8%和21.3%）,但二者杀伤率之间并无差异；而tmTNF-α和CDDP对转染A59-91-EST3和Δ42-105-EST3的HepG2细胞杀伤效率几乎与对照组相同,即上述两个突变体使EST3的促胞毒作用完全丧失。提示EST3促进tmTNF-α和顺铂对靶细胞的杀伤可能与其核糖体功能相关,而与其酪氨酸激酶磷酸化位点无关。2.转染EST3及其突变体对tmTNF-α和CDDP介导细胞凋亡的影响：在tmTNF-α和CDDP的作用下,与对照组相比,转染wtEST3和Δ16-22-EST3突变体的HepG2细胞发生明显凋亡,其细胞核呈现染色质浓缩、变形、断裂的荧光碎片；且因细胞凋亡而出现相似的、明显的亚G1峰；而转染Δ59-91-EST3和A42-105-EST3突变体的HepG2细胞发生凋亡的程度明显减弱膜,其亚G1峰与转染空载的细胞无明显差异。上述现象充分表明,EST3可能通过其蛋白翻译功能而不是通过对激酶功能的影响提高tmTNF-α和顺铂对HepG2细胞的致凋亡作用。七.EST3可促进凋亡蛋白如caspase-3的合成增强tmTNF-α和顺铂对HepG2的杀伤：1.利用放线菌酮（CHX）抑制蛋白翻译：上述实验提示EST3的促凋亡作用与其核糖体蛋白功能相关,为进一步证实这种关系,我们利用蛋白合成抑制剂CHX对EST3促tmTNF-α和CDDP杀伤的影响进行进一步证实。2.EST3对HepG2细胞表达caspase-3的影响：Western blot结果显示,与对照组相比,转染EST3可明显促进caspase-3的表达；反之,转染反向EST3重组质粒caspase-3表达显著减少,提示EST3可能通过其核糖体功能促进促凋亡分子如caspase-3的表达,从而提高靶细胞对tmTNF-a和CDDP杀伤的敏感性。结论：①高表达EST3可促进tmTNF-a和顺铂（CDDP）对HepG2的胞毒效应和细胞凋亡；②抑制EST3的表达则可降低tmTNF-a和顺铂对K562细胞的杀伤；③EST3促tmTNF-a和顺铂杀伤作用与其核糖体功能域相关,与其酪氨酸激酶磷酸化位点无关；④EST3可促进caspase-3的合成和表达。上述结果提示EST3可通过其核糖体功能促进某些促凋亡蛋白如caspase-3表达,从而提高靶细胞对tmTNF-a和顺铂杀伤的敏感性。第二部分tmTNF-α、保守序列与其三聚体化相关性研究肿瘤坏死因子超家族（tumor necrosis factor superfamily, TNF-SF）,包括TNF-α、TNF-β、LT-β、CD27L、CD30L、CD40L、CD95L （FasL）、41BB、OX40L、TRILL等20个成员,它们的共同特征是形成三聚体结构,虽然各个成员的氨基酸序列、空间构型、结合受体及其生物学作用均不相同,但这些膜蛋白的共同特征是具有三聚体化倾向,并且三聚体是这些分子的生物活性形式。它们在一级结构上的唯一共同之处就是其胞外段的高度保守氨基酸序列。故我们推测TNF超家族成员的高度保守序列很可能是形成其共同特征即三聚体化的分子基础。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF-α）为TNF-SF的成员之一,参与炎症反应、免疫应答、抗肿瘤和内毒素性休克等。分子生物信息学研究进一步提示tmTNF-α单体间相互连接部位正好位于高度保守序列,即tmTNF-α一级结构中的9-16、48-62、119-132、151-157位氨基酸片段。为了阐明TNF超家族保守序列与TNF超家族成员三聚体结构的关系,本课题通过突变这些保守序列中可能参与三聚体形成的关键氨基酸位点,观察对三聚体形成及其生物学活性的影响,以确认参与三聚体形成的关键氨基酸。本研究主要结果如下：一. tmTNF-α及tmTNF-α突变体重组质粒构建与鉴定：利用重叠PCR技术,构建保守片段缺失的tmTNF-a突变体（Δ54-59、Δ119-126、Δ119-124、Δ119-122、Δ119-120、Δ115-118）及点突变体（H15P、G54F、G54N、158A, I58Y、G121F、F124A、F124S、L126T、F152S和G153F）,经菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定确认除预期突变外,无任何其它点突变,移码和缺失突变,提示突变体构建成功。二. tmTNF-α及其突变体转染效率与表达率的分析：将tmTNF-α及其突变体转染293T细胞后,用GFP检测tmTNF-α及其突变体转染效率,用TNF抗体检测tmTNF-α及其突变体的表达率。实验结果表明,各突变体除I58Y、F124A、F124S和G153F外,转染效率和表达率与野生型tmTNF-α无显著差异,提示这些突变体基本不影响蛋白合成与在膜上的表达。三. tmTNF-α保守氨基酸突变对tmTNF-α杀伤功能的影响：采用胞毒实验证实,缺失保守片段Δ54-59与Δ119-126的tmTNF-α胞毒作用几乎全部消失,后一片段从缺失8个减少至缺失2个氨基酸,均无胞毒效应；保守位点的点突变中H15P、G54F、G54N、I58Y和L126T点突变使tmTNF-α胞毒效应几乎完全丧失,而其它位点突变对tmTNF-α杀伤效应均有不同程度的影响（抑制率40%-80%）。提示tmTNF-α保守序列或位点突变均可影响tmTNF-α的生物学功能。四. tmTNF-α保守氨基酸突变对其三聚体形成的影响：用化学交联检测tmTNF-α及其突变体是否影响三聚体的形成,结果显示转染野生型tmTNF-α、G54N-tmTNF-α和I58A-tmTNF-α可见清晰的二聚体和三聚体的形成,而H15P、G54F和I58Y点突变以及所有的缺失突变的突变体只在单体位置可见特异性条带,故推测tmTNF-α能否形成三聚体不但与保守序列突变的位点相关,而且与突变的氨基酸性质相关。提示上述突变体影响tmTNF-α的杀伤功能可能与其不能形成三聚体有关。五. tmTNF-α保守位点突变对sTNF-α释放及其生物学功能的影响：1.转染tmTNF-α突变体的细胞培养上清的杀伤功能减弱：收集tmTNF-α及其突变体48小时的细胞培养上清,用MTT法观察上清中sTNF-α的胞毒作用。结果显示,转染野生型tmTNF-α细胞培养上清有明显的杀伤作用,而转染缺失突变体的细胞培养上清几乎丧失杀伤效应；H15P, G54F、I58Y和F124S点突变使sTNF-α胞毒作用几乎丧失；其余点突变体部分损害其胞毒效应。上述结果提示,tmTNF-α保守性氨基酸突变明显影响其上清的胞毒作用,其原因可能是产生的sTNF-α因丧失三聚体而失活,或膜分子在单体的情况下不能被酶解成分泌型分子。2. tmTNF-α保守氨基酸突变对sTNF-α释放的影响：为证实上述推测,我们用ELISA检测转染tmTNF-α及其突变体细胞培养上清中sTNF-α的水平。结果显示转染野生型tmTNF-α细胞的培养上清中有大量sTNF-α（达593.29pg/ml）,而转染缺失突变的tmTNF-α细胞培养上清均未检测到sTNF-α转染点突变的tmTNF-α细胞中,H15P、I58Y和F124S未检测到sTNF-α而G54F、G54N和I58A可检测到sTNF-α的分泌,且与野生型tmTNF-α组无统计学差异。提示tmTNF-α可因保守序列缺失或某些位点突变而不被水解成sTNF-α,这可能与突变体不能形成三聚体有关。六. FasL对应TNF的保守位点突变对其生物学效应的影响1. FasL及其突变体重组质粒的构建与鉴定：上述结果证实His15和Gly54是tmTNF-α三聚体形成的关键性保守位点,故我们在FasL相应的位点上构建相同的突变体（H49P和G88F）,经菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定确认除预期突变外,无任何其它点突变,移码和缺失突变,提示突变体构建成功。2. Annexin V-PI法检测FasL及其突变体的胞毒作用：采用5mM PHA刺激Jurkat T细胞12小时,使Fas表达率大约为30%左右,AICD率为35%,并以此状态的Jurkat T细胞作为靶细胞,以FasL及其各突变体转染293T细胞为效应细胞,观察其诱导的凋亡率。结果显示：只有转染野生型FasL的细胞才有杀伤作用,其突变体均丧失胞毒效应,提示TNF超家族的保守序列对维持该家族成员的生物学效应具有重要作用。结论：（1）tmTNF-α的保守序列54-59与119-126片段对该分子三聚体的形成及生物学活性具有重要作用,后一片段缩短至2个氨基酸缺失仍能发挥作用。（2）tmTNF-α的保守序列中His15、Gly54和Ile58为三聚体形成的关键氨基酸位点。（3）干扰TNF-α膜分子三聚体的形成,不但使其杀伤活性丧失,且可能抑制其可溶性分子的产生。（4）tmTNF-α保守氨基酸同样影响TNF家族其他成员如FasL的胞毒作用,是否与其三聚体形成相关,尚待研究。本研究初步阐明tmTNF-α保守序列为其三聚体化和生物学功能所必须,并影响TNF超家族其他成员FasL的杀伤效应；该研究为tmTNF-α及TNF超家族的结构与功能的关系提供了重要的实验依据。