研究背景：再生障碍性贫血是一种由于骨髓造血干细胞功能和数量改变而引起的以外周血全血细胞减少为主要临床症状的血液疾病。目前认为，免疫功能尤其是T细胞免疫功能紊乱是再障发生的主要机制。DC细胞作为专职抗原提呈细胞，通过摄取、加工处理和提呈抗原，从而激活T细胞。T细胞增殖活化，并选择性高表达Th1、Th17、CD8+T细胞，低表达Th2、Treg细胞。Th1细胞一方面可以直接分泌细胞因子介导骨髓衰竭；另一方面，Th1细胞可以促进CD8+T细胞的增殖活化，从而介导造血干细胞的凋亡、坏死。Th17细胞可以通过自身分泌IL-10、IL-17、IL-21、IL-22等细胞因子，从而破坏骨髓造血干细胞。CD8+T细胞可以通过穿孔素、颗粒酶、TNF等途径杀死造血干细胞，从而导致骨髓衰竭。Treg作为一种调节性T细胞，在再障患者体内表达降低，功能改变，从而丧失对细胞免疫的调节，最终导致自身免疫的过度反应，从而导致再障的发生。目前，临床治疗再障的方法有：骨髓移植疗法、免疫抑制疗法、雄激素疗法等。虽然上述方法可以选择性治疗部分患者，但其毒副作用亦不容忽视。因此，寻找一种高效、低毒的新型治疗药物具有重要意义。2007年，Ohsawa等人研究发现氢气可以选择性清除羟自由基，发挥抗氧化作用。从此，世界范围内掀起了氢气生物学研究的热潮。大量研究表明，氢气可以有效降低多种细胞因子，如TNF-α、IFN-γ、IL等，从而有效治疗多种疾病。本教研室在初步研究氢气的辐射防护作用基础上，进一步研究了氢气对血液疾病的治疗，并且发现氢气可以治疗急性移植物抗宿主疾病。但是，关于氢气对再生障碍性贫血的治疗作用，未见研究报道。本课题以再障小鼠为研究对象，探讨富氢溶液对再生障碍性贫血的治疗作用及其机制研究。研究内容：1.小鼠再生障碍性贫血模型的建立2.富氢溶液对再障小鼠体重的影响3.富氢溶液对再障小鼠外周血的影响富氢溶液对小鼠外周血白细胞、红细胞、血小板、血红蛋白的影响4.富氢溶液对再障小鼠骨髓的影响4.1、富氢溶液对再障小鼠骨髓有核细胞的影响4.2、富氢溶液对再障小鼠骨髓微环境的影响4.3、富氢溶液对再障小鼠骨髓细胞凋亡的影响5.富氢溶液对再障小鼠造血干细胞的影响5.1、富氢溶液对再障小鼠脾结节的影响5.2、富氢溶液对再障小鼠粒结节的影响6.富氢溶液对再障小鼠免疫系统的影响6.1、富氢溶液对再障小鼠T细胞的影响6.2、富氢溶液对再障小鼠TNF-α、IFN-γ、IL的影响研究方法:1.富氢溶液的制备：将高纯度的氢气缓缓灌入生理盐水中，气体与液体的体积比为1:2，在0.4个大气压下2小时过饱和于生理盐水中。缓缓减压，再经过半小时，加压舱的气压降至常压是，将生理盐水袋取出，存放于4度冰箱中备用。2.再障模型的建立：采用5.0Gy照射+尾静脉注射淋巴细胞的免疫介导方法建立再生障碍性贫血动物模型；8-12周CByB6F1小鼠，一次全身照射5.0Gy，照后4小时之内尾静脉注射C57BL/6小鼠淋巴结淋巴细胞混合液0.2ml（5*106/0.2mL）。3.再障小鼠体重的检测：使用电子秤于每天固定时间称量各组小鼠体重并记录，持续28天。4.再障小鼠外周血的检测：眼球取血，并用血常规检测仪检测各组小鼠外周血各指标的改变。5.再障小鼠骨髓的检测5.1再障小鼠骨髓有核细胞的检测：取小鼠股骨，用培养基冲出骨髓有核细胞，稀释，于显微镜下计数。5.2再障小鼠骨髓微环境的检测：取小鼠股骨，使用H-E染色观察小鼠股骨结构及其腔内细胞的改变。5.3再障小鼠骨髓细胞凋亡的检测：取小鼠股骨，使用Tunel染色检测小鼠骨髓腔内细胞凋亡情况。6.再障小鼠造血干细胞的检测6.1再障小鼠脾结节的检测：取小鼠骨髓细胞，尾静脉注射于5Gy照射小鼠，14天后去脾脏并计脾结节数。6.2再障小鼠粒结节的检测：取小鼠骨髓细胞，培养于甲基纤维素培养基中，12天后台盼蓝染色计数。7.再障小鼠免疫系统的检测7.1再障小鼠脾脏T细胞的检测：取小鼠脾脏，研磨为单细胞，抗体标记CD4、CD8细胞，使用流式细胞仪计数。7.2再障小鼠脾脏CD4+细胞各亚型的检测：取小鼠脾脏，研磨为单细胞，提取RNA，进行Real-Time PCR检测Th1、Th2、Treg、Th17。7.3再障小鼠CD4+细胞各亚型相关细胞因子的检测：取小鼠脾脏，研磨为单细胞，提取RNA，进行Real-Time PCR检测相关细胞因子。7.4再障小鼠血清细胞因子的检测：取小鼠外周血，离心并收集血清，使用ELISE检测小鼠外周血血清TNF-α、IFN-γ、IL-6的含量。实验结果：1.富氢溶液对再障小鼠体重的影响再障小鼠持续给氢28天后，其体重显著高于未给氢组（P<0.05），表明氢气可以改善再障小鼠的生存情况。2.富氢溶液对再障小鼠外周血的影响再障小鼠持续给氢28天后，眼球取血，并使用血常规检测仪检测外周血各指标，发现给氢组红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白都高于未给氢组，初步表明富氢溶液可以治疗再生障碍性贫血。3.富氢溶液对再障小鼠骨髓的影响3.1再障小鼠持续给氢28天后，取小鼠骨髓细胞，破红后计数，发现给氢组小鼠骨髓有核细胞数显著高于未给氢组(P<0.05)，表明富氢溶液可以缓减再障小鼠的骨髓相的改变。3.2再障小鼠持续给氢28天后，取小鼠股骨做H-E染色切片，镜下观察发现，给氢组小鼠骨髓腔内有核细胞数显著多于未给氢组，且充血情况得到明显改善，表明富氢溶液可以改善骨髓腔内环境，从而达到治疗再障的目的。3.3再障小鼠持续给氢28天后，取小鼠股骨做Tunel染色切片，镜下观察发现，给氢组小鼠骨髓腔内凋亡细胞数明显少于未给氢组，表明富氢溶液可以缓减免疫系统对骨髓细胞的破坏。4.富氢溶液对再障小鼠造血干细胞的影响4.1再障小鼠持续给氢28天后，取小鼠骨髓细胞做脾结节，发现给氢组小鼠脾结节数明显高于未给氢组，表明富氢溶液可以改善再障小鼠的造血能力。4.2再障小鼠持续给氢28天后，取小鼠骨髓细胞做粒结节，发现给氢组小鼠粒结节数显著高于未给氢组，同样表明富氢溶液可以改善再障小鼠骨髓造血干细胞增殖能力。5.富氢溶液对再障小鼠免疫系统的影响5.1再障小鼠持续给氢14天后，取小鼠脾脏检测CD4、CD8，检测发现CD4、CD8含量明显低于未给氢组，且CD4/CD8趋近于正常组。5.2再障小鼠持续给氢14天后，取小鼠脾脏做PCR，检测发现给氢组转录因子T-bet、Foxp3、RORγt表达显著低于未给氢组，而GATA3表达量则高于未给氢组。5.3再障小鼠持续给氢14天后，取小鼠脾脏做PCR，检测发现给氢组Th1细胞相关因子IFN-γ、IL-12、TGF-β1表达量显著降低；Th2细胞相关因子IL-4表达量降低，而IL-5、IL-10表达量增高；Th17细胞相关因子IL-17与IL-23表达量显著降低。5.4再障小鼠持续给氢14天后，取小鼠血清检测TNF-α、IFN-γ、IL-6，发现给氢组血清TNF-α、IFN-γ、IL-6水平显著低于未给氢组（P<0.05）。分析讨论:再生障碍性贫血是一种血液科常见疾病。我们从外周血、骨髓相、免疫系统三方面研究了富氢溶液对再障的治疗作用。结果显示，氢气可以显著改善外周血各项指标，提高外周血红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白的含量。外周血各项指标尤其是红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白的改善是再障得到有效治疗的直接指标。骨髓微环境的改变和骨髓造血干细胞的缺失是再障发生的主要原因。实验研究发现，氢气可以改善再障小鼠骨髓微环境，增加骨髓有核细胞数量，减少骨髓凋亡细胞，促进骨髓造血干细胞的恢复。免疫功能尤其是细胞免疫功能的紊乱是再障发生的主要病理机制。免疫功能的恢复可以从根本上治疗再障患者。研究发现，氢气可以降低脾脏CD4、CD8的含量，调节CD4与CD8比值，介导CD4细胞各亚型的表达，调节血清TNF-α、IFN-γ、IL-6的含量，从而介导免疫系统，达到治疗再障的目的。结论：我们发现氢气可以有效治疗再障小鼠，有效改善再障小鼠外周血。氢气这一功效可能是通过调节免疫系统，抑制免疫系统对骨髓造血干细胞的破坏而发挥作用的。未来，氢气有可能成为治疗再障的一种新型药物。