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目的血源性的microRNAs(Blood-based circular microRNAs)是一种小型的内源性非编码RNA,其长度通常为19-24个碱基。这些短序列通过碱基配对到信使RNA的3’非翻译区介导转录后基因调控。越来越多的研究证据表明,microRNAs通过与蛋白编码基因的信使RNA(target messenger RNAs,mRNAs)的不完全配对以及其表达的转录或转录后调控,参与关键的生物学过程,包括发育、分化、凋亡和增殖并且microRNAs表达水平的失调参与了人类癌症的发生和发展过程。因此,它是一个有应用价值和微创的癌症生物标志物。遗憾的是,因为microRNAs固有的几个特性,如其表达水平低和具有高度同源性,使得在microRNAs的检测中面临一些挑战。为了实现microRNAs的特异性和灵敏性的检测,为癌症的早期诊断提供重要依据,本文构建了一种新颖的3D-DNA步行机器。方法设计了一种以链霉亲和素包被的聚苯乙烯微球为载体的3D-DNA步行机器。以nicroRNA 21作为模型靶标分析物,在其存在的条件下发生熵驱动链置换反应,实现了DNA步行机器的连续行走。从而使得聚苯乙烯微球上三核酸复合物分解,并导致microRNA 21的循环。三核酸复合物中的大量辅助核酸的释放诱导了催化发夹自组装反应,由此产生可检测的荧光。结果1聚苯乙烯微球的表征结果:聚苯乙烯微球在扫描电镜下是一个圆球形,呈现出良好的分散性和高度的均匀性,它的平均尺寸大约为800 nm。2可行性验证:用琼脂糖凝胶电泳和荧光分光光度计分别验证了熵驱动的3D-DNA步行机器联合催化发夹自组装反应检测microRNA是可行的,在目标存在下可检测到的荧光值,明显高于背景信号。3传感器分析性能评价:在最优的实验条件下,对不同浓度的目标物nicroRNA 21进行检测,利用荧光分光光度计检测信号。在50 pM至20 nM范围内荧光信号与目标物浓度的对数呈线性相关(R~2=0.997),经过计算得到最低检测限为41 pM(S/N=3)。由于熵驱动链置换反应触发了3D-DNA步行机器,在与其它同族的microRNAs进行特异性检测时发现microRNA 21的信号能很明显的与其它microRNAs区别出来。4加标回收实验结果:在10倍稀释的血清样本中,三种不同浓度样本(200 pM、1 nM、5 nM)的回收率分别为99.8%,102.0%,104.8%。结论我们设计了一种新型熵驱动的3D-DNA步行机器并联合催化发夹自组装反应。该生物传感器成功地应用于皮摩尔水平nicroRNA 21的检测具有如下优点。首先,它是一个免酶的体系,不需要较高的检测成本和严苛复杂的反应条件,并舍弃了繁琐的热循环程序。此外,我们使用链霉亲和素包被的聚苯乙烯微球作为3D-DNA步行机器的轨道,工业化的聚苯乙烯微球具有良好的均一性和重复性。最后,我们直接将目标设计作为触发熵驱动链置换反应的随机DNA步行者,不同于使DNA步行者固定在轨道上的设计,也不需要优化步行者和锚定基质核酸的比例,使3D-DNA步行机器的结构较为简单。综上所述,我们认为这种整合的无酶3D-DNA步行机器联合CHA反应能够在即时检验诊断中具有潜在的应用价值。