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莲腐败病是我国白莲产业上的重要病害之一。它是一种土壤传播性病害,主要由尖孢镰刀菌莲专化型(Fusarium oxysporum f.sp.nelumbicola)引起。莲腐败病菌在侵入寄主植物时能分泌一系列细胞壁降解酶,主要包括多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG),果胶甲基半乳糖醛酸酶(Polymethylgalacturonase,MG),纤维素酶(Cellulose,Cx),多聚半乳糖醛酸转移消除酶(Polygalacturonic acid trans-eliminase,PGTE)和果胶甲基转移消除酶(Pectin methyltrans-eliminase,PMTE)。其中多聚半乳糖醛酸酶(PG)被认为是许多植物病原菌的重要致病因子之一,在致病过程中起重要作用。为了研究PG同工酶基因在莲腐败病菌致病过程中的作用,本实验的研究内容作如下安排:1.酶活测定。为明确莲腐败病病菌在致病过程中起主要作用的降解酶,本文对莲腐败病病菌的5种细胞壁降解酶的酶活进行了测定,结果表明多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)和纤维素酶(Cellulase,Cx)均有较大活性,分别为4.89,6.38 U/mg;果胶甲基半乳糖醛酸酶(Polymethylgalacturonase,PMG)、多聚半乳糖反式消除酶(Polygalacturonic acid transeliminase,PGTE)、果胶甲基反式消除酶(Pectin methyltranseliminase,PMTE)最大活性分别为2.60,0.531,0.093 U/mg。PG和Cx的活性明显比PMG、PGTE和PMTE的高,这表明莲腐败病病菌在致病过程中起主要作用的细胞壁降解酶为多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶。2.通过RT-PCR和RACE方法对莲腐败病菌的pg1、pg5全长cDNA进行克隆。pg1的全长cDNA是一个包含371个氨基酸的完整开放阅读框,pg5的全长cDNA是一个包含360个氨基酸的完整开放阅读框。这两个基因全长包含了PG的两个高保守区域。BLAST比对结果表明这两个基因的氨基酸序列与其他相近种的PG氨基酸序列相似。通过聚类分析表明pg1和pg5与尖孢镰刀菌的pg基因最接近。另外,pg1的DNA序列全长共1319 bp,由5个外显子和4个内含子组成,pg5的DNA序列全长共1131 bp,由2个外显子和1个内含子组成。所有的外显子和内含子连接序列都遵从GT/AG原则。3.PG同工酶基因的原核表达。本研究将获得的pg1的全长cDNA和pg5的全长cDNA重组至原核表达载体PET30a(+)。构建的原核重组表达载体PET30a-pg1和PET30a-pg5转化至大肠杆菌BL21中,利用单菌落PCR鉴定获得阳性重组子,阳性重组子用ITPG进行诱导表达。通过SDS-PAGE分析结果表明pg1表达蛋白在38 KDa左右处有一特异性蛋白条带,pg5表达蛋白在37 KDa左右处有一特异性蛋白条带。