【摘 要】
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目的:通过研究高糖环境培养下大鼠肾小球系膜细胞（HBZY-1）NLRP3炎症小体的表达及其相关炎性因子、纤维化因子的表达;运用NLRP3si RNA的干扰技术及血管紧张素受体拮抗剂（ARB类药）干预受高糖刺激后的HBZY-1,检测上述指标的表达变化,探讨NLRP3炎症小体在糖尿病肾脏疾病的潜在作用机制,初步探究厄贝沙坦是否能阻断NLRP3炎症小体的作用;设计不同时间点,验证高糖刺激的时间长度对NL
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目的:通过研究高糖环境培养下大鼠肾小球系膜细胞（HBZY-1）NLRP3炎症小体的表达及其相关炎性因子、纤维化因子的表达;运用NLRP3si RNA的干扰技术及血管紧张素受体拮抗剂（ARB类药）干预受高糖刺激后的HBZY-1,检测上述指标的表达变化,探讨NLRP3炎症小体在糖尿病肾脏疾病的潜在作用机制,初步探究厄贝沙坦是否能阻断NLRP3炎症小体的作用;设计不同时间点,验证高糖刺激的时间长度对NLRP3炎症小体及通路相关分子的表达变化。方法:使用慢病毒包装NLRP3si RNA,以带有绿色荧光的GFP-Bsd作为阴性对照。设计MOI值的浓度梯度,使用阴性病毒感染HBZY-1,荧光显微镜下观察细胞转染阳性率,实时荧光定量（Q-PCR）检测NLRP3 m RNA的表达变化,摸索最合适的MOI值用于后续实验。实验分3部分进行:第1部分:细胞分3组:低糖对照组（LG,5.6 mmol/L葡萄糖）、甘露醇组（M,5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇）和高糖组（HG,30 mmol/L葡萄糖）,初步验证高糖、高渗的对NLRP3表达的影响。第2部分:经慢病毒感染,将沉默NLRP3质粒转染至HBZY-1细胞中,实验分为低糖组（LG组）,低糖+NLRP3si RNA组（LG+NLRP3-sh组）,低糖+空载组（LG+sh组）,验证NLRP3si RNA干扰效果。第3部分:实验分为5组两个时间点（24h、48h）:LG组、HG组、HG+sh组、HG+NLRP3-sh组、HG+厄贝沙坦组（HG+ARB组）,采用Q-PCR法检测24h、48h的NLRP3、胱冬肽酶-1（caspase-1）、核因子kB（NF-kB）m RNA的表达;Western Blot检测24h、48h的NLRP3、热休克蛋白47（HSP47）、NF-kB、Ⅳ型胶原蛋白（Coll V）,ɑ-肌动蛋白（ɑ-SMA）的蛋白表达;ELISA法检测细胞上清液白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-ɑ（TNF-ɑ）的表达水平。结果:1.与低糖组比较,高糖组NLRP3 m RNA表达增加（P<0.05）,差异具有统计学意义,甘露醇组NLRP3 m RNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。2.五组细胞干预处理24h后,与低糖组比较,高糖组及高糖+sh组NLRP3m RNA的表达显著增加（P<0.01）,Caspase-1、NF-kB m RNA的表达明显增加（P<0.05）,NLRP3、HSP47、NF-kB、ɑ-SMA、COl IV蛋白的表达明显上调（P<0.05）,细胞上清液IL-1β、TNF-ɑ的表达明显增加（P<0.01）;与高糖组相比,高糖+NLRP3-sh及高糖+ARB组的NLRP3、Caspase-1 m RNA的表达显著下调（P<0.01）NF-kB m RNA的表达明显下调（P<0.05）,以上蛋白表达显著下调（P<0.01）,IL-1β及TNF-ɑ的表达显著下调（P<0.01）,高糖组与高糖+sh组以上指标的改变差异无统计学意义。3.五组细胞干预处理48h后,与低糖组比较,高糖组及高糖+sh组NLRP3m RNA的表达显著增加（P<0.01）,Caspase-1、NF-kB m RNA的表达明显增加（P<0.05）,NLRP3、HSP47、NF-kB、ɑ-SMA、COl IV蛋白的表达明显上调（P<0.05）,细胞上清液IL-1β、TNF-ɑ的表达明显增加（P<0.01）;与高糖组相比,高糖+NLRP3-sh及高糖+ARB组的NLRP3、Caspase-1 m RNA的表达显著下调（P<0.01）NF-kB m RNA的表达明显下调（P<0.05）,以上蛋白表达显著下调（P<0.01）,IL-1β及TNF-ɑ的表达显著减少（P<0.01）,高糖组与高糖+sh组以上指标的改变差异无统计学意义。4.细胞经高糖干预处理24h,48h后,与24h高糖组比较,48h高糖组NLRP3表达显著上调（P<0.01）、Caspase-1、NF-kB m RNA的表达明显下调（P<0.05）,NLRP3、HSP47、NF-kB、ɑ-SMA、COl IV蛋白的表达显著增加（P<0.01）,IL-1β及TNF-ɑ的表达明显增加（P<0.05）、TNF-ɑ表达显著增加（P<0.01）。结论:高糖可激活NLRP3炎症小体表达,诱导肾小球系膜细胞分泌炎性因子,以及纤维化因子表达上调。厄贝沙坦及特异性基因沉默可阻断由高糖诱导的NLRP3炎症体的激活,下调炎性因子释放及纤维化蛋白的表达。且通过本实验发现,NLRP3炎症小体激活表达与时间呈一定的相关性。
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