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目的:在人体肿瘤微环境中,处于低氧条件下的肿瘤细胞侵袭和促进血管生成的能力更强,除了公认的VEGF可促进血管形成,外泌体（Exosomes,Exo）在远距信息调控中起到了重要作用。本文将明确在低氧条件下,外泌体Cx43表达上调在脑胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）低氧微环境新生血管生成中具有重要作用,使肿瘤的转移和侵袭能力增强。通过该研究将更全面地认识GBM的病理机制,并为脑胶质瘤的防治奠定新的理论基础和提供新的药物靶点。方法:1、分别对脑胶质母细胞瘤U251细胞在常氧和低氧条件下分泌的外泌体进行分离与鉴定:首先将U251细胞放置于常氧培养箱中培养,当细胞融合度至70%左右,更换培养基为不含血清的DMEM,然后将细胞分成两组:一组在常氧条件下继续培养,一组移至低氧条件下培养。48 h后收集培养基,采用差速离心法提取、分离外泌体,分别称为常氧外泌体（normoxia-exosomes,Nor-Exo）,低氧外泌体（hypoxia-exosomes,Hypo-Exo）。用TEM观察Nor-Exo和Hypo-Exo的形态,Western blot实验验证外泌体中的标志蛋白CD63和TSG101以及检测其中Cx43蛋白的表达情况,马尔文粒度分析仪观察外泌体的粒径分布范围。2、确证Hypo-Exo能够影响HUVECs的增殖、伤口愈合、侵袭和血管形成并验证外泌体Cx43在其中的作用。用含10%FBS的完全培养液培养HUVECs并接种于培养板中,实验分为四组:PBS组（Cont）,Nor-Exo组,Hypo-Exo组,Hypo-Exo+37,43gap27组。将后三组外泌体按照100μg/ml的浓度分别加入到HUVECs中共孵育,24 h、48 h后检测Hypo-Exo对HUVECs的增殖、伤口愈合、侵袭和10 h后对血管形成的影响。3、确证Hypo-Exo中Cx43蛋白对HUVECs摄取外泌体的影响。构建沉默Cx43的U251稳转细胞株,于低氧条件下培养并提取外泌体,该组外泌体为Cx43-sh RNA-Hypo-Exo。实验分为四组:Nor-Exo组,Hypo-Exo组,Hypo-Exo+37,43gap27组,Cx43-sh RNA-Hypo-Exo组。观察外泌体中Cx43蛋白对HUVECs摄取外泌体的影响并统计其摄取效率。用Dio对四组外泌体进行染色,之后外泌体按照100μg/ml的浓度分别与HUVECs共孵育,荧光显微镜拍摄各组HUVECs在共孵育4 h,8 h和12 h对外泌体的摄取情况。结果:1、经电镜、马尔文粒径分析和Western blot结果显示,外泌体形态多为双凹圆盘状,直径约在80～130 nm之间,无杂峰出现,可检测出外泌体膜特异性分子标志CD63和TSG101。Hypo-Exo中Cx43表达较Nor-Exo中Cx43表达显著增加（p<0.05）。2、上述各组外泌体与HUVECs共孵育24 h,各组细胞的增殖无显著性差异;当共孵育48 h时,Hypo-Exo组与Nor-Exo组相比,细胞的增殖能力明显增强（p<0.01）。Cx43抑制剂37,43gap27能够显著抑制由Hypo-Exo诱导的HUVECs的增殖（p<0.01）;伤口愈合和侵袭实验表明Hypo-Exo组在24 h和48 h均可以显著促进HUVECs的伤口愈合和侵袭,且48 h促进伤口愈合的能力更强（p<0.01）。同样,37,43gap27能够显著抑制由Hypo-Exo诱导的HUVECs的伤口愈合和侵袭;体外血管形成实验发现,与Nor-Exo组相比,Hypo-Exo共孵育的HUVECs的成管能力显著增强（p<0.05）,而Hypo-Exo+37,43Gap27组的成管能力显著下降（p<0.05）。这些结果提示从低氧条件下培养的U251细胞提取的外泌体即Hypo-Exo能显著促进HUVECs增殖、伤口愈合、侵袭及血管形成,该作用可能与Hypo-Exo中Cx43表达增多有关。3、细胞摄取实验发现HUVECs能够摄取标记绿色荧光的外泌体;HUVECs在12 h内能将大量的外泌体摄取内化入细胞,HUVECs对Nor-Exo的摄取率约为45%;HUVECs对Hypo-Exo的摄取率约为73%,显著高于对Nor-Exo的摄取（p<0.01）;而Cx43-sh RNA-Hypo-Exo和Hypo-Exo+37,43Gap27组被HUVECs吸收的摄取率分别约为41%和37%,与Hypo-Exo相比,它的摄取率明显降低（p<0.01）。以上结果提示Hypo-Exo能够被HUVECs大量摄取,抑制Hypo-Exo中Cx43表达或敲低Cx43表达可以明显抑制或逆转HUVECs对Hypo-Exo的摄取（p<0.01）。结论:1、低氧条件下,胶质母细胞瘤分泌的外泌体中Cx43表达上调。2、低氧条件下,胶质母细胞瘤分泌的外泌体能显著增强肿瘤细胞的增殖、伤口愈合、侵袭和血管形成。3、低氧条件下,HUVECs对外泌体的摄取率增加,该作用与外泌体中Cx43的表达上调有关,详细机制有待今后深入研究。