对猪注射或皮下埋植猪生长激素(porcine growth hormone, pGH)可提高猪的饲料利用率,促使其脂肪向蛋白转化,还能提高瘦肉率。伴随着分子生物学和基因工程的快速发展,转基因动物的研究日新月异。转pGH基因猪体重增加的非常快,饲料利用率可大幅提高。但这些转pGH基因动物在表现出较高生产性能的同时,也出现了关节炎、胃溃疡、不育等疾病。如果能让pGH基因在猪体内适度高表达,这样获得转pGH基因的猪既具有较高的生产性能,也避免了pGH基因长时间,高强度表达对机体造成的副作用。四环素诱导表达系统(Tetracyclin inducible gene expression system, Tet-On system)正是这样一种具有“开”基因功能的基因诱导表达系统,该系统具有调控严密、诱导效率高、背景表达低和诱导剂副作用小等优点,是生产转诱导型基因动物的理想调控系统。本研究的主要目的是将Tet-On系统应用到转诱导型pGH基因猪中,通过显微注射、转基因徒手克隆的方法初步获得携带有pGH诱导表达基因片段的转基因后代。进一步开发肝脏特异表达启动子,为研究定时、定量和定位的pGH诱导表达转基因猪打下基础。最后系统检测了pGH作用的下游基因的表达规律,为转诱导性pGH基因猪诱导条件的确立提供了参考依据。1、利用显微注射线性DNA片段的方法生产转Tet-On诱导的pGH基因猪研究猪胚胎干细胞系的建立非常困难,这从一定程度上限制了转基因核移植技术不能像应用在小鼠上一样广泛。原核注射虽然具有整合位点和拷贝数不确定等缺点,但由于该方法具有发展时间长、技术稳定和对胚胎伤害小等优点,目前仍是生产转基因猪的首选方法。本试验首先构建了单质粒Tet-On诱导的pGH基因表达系统,并通过转染大白猪胎儿成纤维细胞(Porcine Embryonic Fibroblasts, PEF)在mRNAs水平和蛋白水平上验证了该系统的调控功能。结果表明：(1)在Dox浓度为10μg/mL的PEF培养基中诱导48小时后,诱导组(Dox+Plasmid) pGH的mRNA表达量是空白组(Dox)和非诱导组(Plasmid)的十倍以上(P<0.01)。空白组和非诱导组之间pGH的表达差异不显著(P>0.05)。(2)诱导组(Dox+Plasmid)与空白组(Dox)和非诱导组(Plasmid)相比,培养基中pGH蛋白含量差异均为极显著(P<0.01),空白组和非诱导组之间差异不显著。验证完诱导表达系统的功能后,接下来通过显微注射PRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced线性片段(生长激素诱导表达片段)的方法获得了9头G0代转诱导型pGH基因猪。将GO代转诱导型pGH基因猪和非转基因母猪配种,对其后代进行检测,初步确定有7头F1猪为阳性,表明通过显微注射获得的FO转基因猪有生殖系嵌合情况,但大部分为非生殖系嵌合体。2、稳定表达转诱导型pGH基因细胞系的建立首先,本研究通过胰蛋白酶消化法建立了梅山猪胎儿成纤维细胞系。其次,通过慢病毒和睡美人系统介导分别建立了转诱导型p6H基因的大白猪和梅山猪PEF系。在转转诱导型pGH基因的大白猪PEF系上,经Dox诱导48小时后,其培养基中pGH浓度达到9.493±0.677ng/mL,显著高于诱导0小时和24小时后培养基中pGH浓度,同时通过DAPI带型分析,经过6次消化传代的细胞,其染色质组没有出现数目的变化,染色体形态表现正常。为进一步提高睡美人系统介导的转基因整合效率,采用两步法将pCMV-SB-Ul tra和pKT2/CMV-GFP-IRES-Puro间隔42小时转染入梅山猪PEF,得到的GFP基因整合效率要显著高于一步法(p<0.05),效率为一次转染的4倍左右。3、肝脏强效特异表达启动子的构建组织特异性表达避免了对其它本不表达该基因的器官和组织的伤害,有利于转基因动物的健康。GH能够通过JAK-STAT信号通路催生类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor I,IGF I),IGF I可对机体大部分组织具有生长调控作用。肝脏是发生这一过程的主要场所。基于此,本实验开发的CMV enhancer/SAP224复合启动子可以用于肝脏特异性基因的表达调控。经Dual-Lucifera se(?)报告基因检测系统检测发现：CMV enhancer/SAP224的转录能力相对于野生型的白蛋白启动子得到了极显著提升,其在猪和小鼠肝脏中的荧光素酶活性是CMV启动子的0.4倍左右,具有较高的组织特异性。CMV enhancer/SAP224无种间特异性,可在猪和小鼠肝脏中特异诱导荧光素酶基因的表达。4、猪心、肝、脾、肺、肾、脑和肌肉GHR、IGF Ⅰ R和IGFⅡ R的mRNA发育表达规律GHR、IGFⅠR和IGFⅡ R是GH/IGF轴上调控生长的作用终端。因此GHR、IGFⅠR和IGFⅡR在组织细胞中的时空表达模式就能够反映出动物个体的生长发育时程。为了给转四环素诱导型pGH基因猪诱导条件的确定提供参考依据,本研究系统检测了猪GH作用的下游基因GHR、IGF Ⅰ R、IGF Ⅱ R在猪50胎龄、70胎龄、90胎龄、1日龄、20日龄、70日龄、120日龄、180日龄的心、肝、脾、肺、肾、脑和肌肉中的表达情况。结果发现：GHR和IGFⅡR在猪心、肝、脾、肺、肾、脑和肌肉中的发育表达模式有一个共同的规律,即在猪70日龄时,其GHR和IGFⅡR表达量均处于最高峰,而IGF Ⅰ R规律性不强。由此推断,70日龄前后是猪生长速度最快的时期。因此将猪70日龄前后确定为转诱导性pGH基因猪诱导表达的最佳时期。