研究背景:龋病是一种主要由细菌感染引起,发生在牙体硬组织的慢性进行性破坏性疾病。牙菌斑生物膜是龋病发生的关键因素,它是由多种微生物组成的复杂微生物群落,具有高度的结构性。目前,临床上最常见的防龋方法是药物防龋,其主要目的就是抑制致龋性生物膜的形成。但是传统抗菌药物由于存在利用率低、毒副作用大、时效短等问题,在临床上的应用受到限制。纳米载药系统能够增溶药物、高效载药、缓释药物、降低毒副作用,在口腔防龋方面具有广阔的应用前景,但是由于牙菌斑生物膜独特的结构,以及口腔内复杂的环境,传统纳米载药系统难以在生物膜中富集和停留,并且易受到生物膜中基质或酶等成分的影响,从而难以达到理想的抗菌作用。因此,如何让纳米载药系统在生物膜内发挥更好的作用,是当前防龋药物研究的热点和重点。近年来新兴的细胞膜包裹纳米粒子技术为我们解决上述问题提供了新的思路和方法。细胞膜包裹纳米粒子技术是在传统纳米载药系统的外层包裹一层细胞膜,使其能够继承源细胞膜表面固有特性,从而具有与源细胞类似的行为和功能。不同种类和功能的细胞膜可以让纳米载药系统获得各种不同的应用效果。研究表明,乳酸杆菌可借助其外膜表层特性与变异链球菌发生共聚集,从而发挥抑制变异链球菌生物膜形成和生长的作用。因此,受细胞膜包裹纳米粒子技术和乳酸杆菌的启发,本研究旨在利用乳酸杆菌外膜对负载有抗菌药物的纳米粒子进行包裹,构建一种新的防龋纳米载药系统,并证实该系统能够继承源乳酸杆菌外膜的特性,与变异链球菌及其生物膜相互作用,从而介导防龋药物在生物膜内的富集和传递,抑制生物膜致龋性,为解决现有防龋纳米载药系统研究和应用面临的关键问题提供新方法。研究目的:本研究旨在构建乳酸杆菌外膜包裹的纳米载药复合物并探究其抑制致龋生物膜的潜力。研究方法:1.乳酸杆菌外膜包裹PLGA纳米粒子的制备及表征:首先采用研磨法机械破坏细菌结构,差速离心分离外膜,然后采用纳米沉淀法制备载TCS药物的PLGA纳米粒子（TCS@PLGA-NPs）,最后提取的乳酸杆菌外膜与TCS@PLGA-NPs通过脂质体挤出仪共挤得到乳酸杆菌外膜包裹载TCS的PLGA纳米粒子（LA/TCS@PLGA-NPs）。接下来对合成的LA/TCS@PLGA-NPs进行一系列的表征与鉴定,体外评价LA/TCS@PLGA-NPs的粒径、电位、形态、稳定性、药物包封率和载药率以及药物释放率等;SDS-PAGE法检测LA/TCS@PLGA-NPs上乳酸杆菌外膜蛋白的保留情况;根据S-层蛋白在乳酸杆菌外膜外侧不对称分布的特性检测LA/TCS@PLGA-NPs膜侧位性;BCA法检测LA/TCS@PLGA-NPs蛋白负荷量;CCK-8法检测LA/TCS@PLGA-NPs的体外细胞毒性。2.LA/TCS@PLGA-NPs对变异链球菌生物膜抑制作用研究:利用激光共聚焦显微镜（CLSM）和扫描电镜（SEM）观察变异链球菌与乳酸杆菌共聚集现象,并且定量分析共聚集率;通过CLSM检测LA/PLGA-NPs对浮游变异链球菌的黏附作用,并探究其黏附机制;利用CLSM观察LA/PLGA-NPs在变异链球菌生物膜中的空间分布,定量分析变异链球菌和LA/PLGA-NPs的荧光体积,进一步探究纳米粒子在生物膜中的整合情况;采用结晶紫染色法定量分析LA/PLGA-NPs对生物膜形成的影响;采用活死菌染色法探究LA/TCS@PLGA-NPs对处于不同形成阶段的生物膜活性的影响;RT-qPCR检测LA/TCS@PLGA-NPs对生物膜致龋相关基因表达的影响。体内检测LA/TCS@PLGA-NPs对大鼠龋病防治的作用。研究结果:1、采用研磨法和差速离心法成功提取得到嗜酸乳酸杆菌外膜,其粒径为269.35±28.61mV;表面电位为-10.68±1.65mV。2、采用纳米沉淀法成功制备负载TCS药物的PLGA纳米粒子,其形态规则,粒径均一,平均粒径为107.60±2.04nm,表面电位为-21.30±0.46mV,TEM观察形态呈圆形,测得包封率为49.7±0.8%、载药率为 19.1±0.3%（n=3）。3、采用脂质体挤出法成功制备嗜酸乳酸杆菌外膜包裹的PLGA纳米粒子,其平均粒径为132.87±9.1nm,表面电位为-12.4±0.75mV。TEM观察形态呈圆形,表面有一层外膜形成“壳层”结构。测得包封率为47.3±1.0%、载药率为 14.8±0.3%（n=3）。4、在4℃下,TCS@PLGA-NPs和LA/TCS@PLGA-NPs在PBS中均具有良好的稳定性。采用紫外分光光度法检测药物释放率,在8h,TCS@PLGA-NPs 和 LA/TCS@PLGA-NPs 释放率分别为 42.2%和36.7%。之后两者释放速度都减慢,在69h,累积约有76.1%和44.5%的TCS分别从 TCS@PLGA-NPs 和 LA/TCS@PLGA-NPs 中释放出来。5、SDS-PAGE凝胶电泳结果显示LA/TCS@PLGA-NPs与提取出的嗜酸乳酸杆菌外膜具有类似的蛋白成分。膜侧位分析显示LA/TCS@PLGA-NPs中S-层蛋白含量为等量嗜酸乳杆菌外膜的94.6%。蛋白负荷实验表示LA/TCS@PLGA-NPs中蛋白负荷量约为0.33±0.04 wt%。6、TCS、TCS@PLGA-NPs和LA/TCS@PLGA-NPs分别在 120μg/mL、160μg/mL和40μg/mL浓度下,对人口腔角质细胞（HOK）的细胞活性均大于75%,属于安全性范围。7、SEM和CLSM图像结果显示变异链球菌和嗜酸乳杆菌能够发生共聚集,并且共聚集率随着共培养时间延长而升高。8、CLSM图像显示经过共培养和冲洗后,LA/PLGA-NPs（绿色红色荧光重叠）聚集在变异链球菌（蓝色荧光）周围,经氯化锂（LiCl）和胃蛋白酶处理后,其荧光几乎消失,但经高碘酸钠和牛血清白蛋白处理后其荧光仍然存在。9、CLSM图像显示在变异链球菌生物膜形成的任意阶段加入LA/PLGA-NPs,它们大多存在于生物膜的中间层,其介导的生物膜的荧光体积均小于未添加纳米粒子介导的生物膜的荧光体积（P＜0.05）。此外,LA/PLGA-NPs荧光体积的增加趋势与生物膜荧光体积的增加趋势一致。10、结晶紫法结果显示分别在生物膜形成的第0h、6h、12h、24h、48h加入LA/PLGA-NPs,LA/PLGA-NPs对生物膜抑制率分别为64.1%、40.3%、21.9%、6.7%和2.0%。11、LA/TCS@PLGA-NPs的抗菌作用较TCS@PLGA-NPs和TCS稳定,在生物膜形成的任何阶段加入LA/TCS@PLGA-NPs,其介导生物膜活性均保持在75%左右（P＞0.05）。12、RT-qPCR结果显示,LA/TCS@PLGA-NPs处理生物膜4天后,其致龋相关的毒力基因gtfB、gtfC、fif、spaP、gbpB、ldh、atpF、comD、vicR与对照组相比,表达显著下调（P＜0.05）。此外,LA/TCS@PLGA-NPs组中gtfB、gtfC、comD、atpF的表达水平显著低于TCS组和TCS@PLGA-NPs组（P＜0.05）。13、动物实验结果显示,LA/TCS@PLGA-NPs平滑面龋评分显著低于对照组（P＜0.05）,LA/TCS@PLGA-NPs的窝沟龋总病变以及初始病变评分与对照组无明显差异（P＞0.05）,而中度病变以及深度病变评分显著低于对照组（P＜0.05）。研究结论:本实验成功合成了以负载TCS的PLGA纳米粒子为核心,以嗜酸乳杆菌外膜为外衣的纳米复合物,此纳米复合物表现出良好的性质,包括尺寸可控、带负电荷、良好的体外缓释作用和生物安全性。LA/TCS@PLGA-NPs能够与变异链球菌“共聚集”,抑制变异链球菌的早期定植,并凭借优良的缓释能力,持续降低变异链球菌生物膜致龋相关基因的表达以及减缓体内龋病的发展。本研究为抑制致龋生物膜的基础研究提供了一种新的设计思路,有助于纳米载药系统在龋病预防应用中的进一步发展。