第一部分Neuroligin-1和neurexin-1β在难治性颞叶癫痫患者及动物模型中的表达目的：脑神经元异常突触传递的同步化能导致癫痫的产生。Neuroligin-1(NL1)是位于兴奋性突触后膜的一种突触粘附分子，它能调节突触传递并能决定中枢神经网络的性质。本研究首先检测了NL1及其突触前膜受体neurexin-1β(NRX1β)在难治性颞叶癫痫（TLE）患者及氯化锂-匹罗卡品（LiCl-PILO）癫痫大鼠模型中的表达，以探讨其在TLE发生及发展中的可能作用。方法：1.从课题组所建脑组织标本库中随机抽取22例难治性TLE患者的颞叶皮质和10例对照组颞叶皮质。2.80只成年雄性SD大鼠随机分为对照组（n=10）和癫痫组（n=70），癫痫组又分为7个亚组（每组n=10），即1d组、2d组、3d组、7d组、14d组、30d组和60d组。癫痫组给予LiCl-PILO进行造模。3.用免疫组化，免疫荧光和免疫印迹三种方法分别检测NL1和NRX1β在颞叶癫痫患者脑组织和癫痫大鼠脑组织中的表达。结果：1.免疫染色显示，NL1蛋白主要在难治性TLE患者及对照颞叶皮质神经元的细胞膜和细胞中表达。NL1在难治性TLE患者脑组织中的免疫组化平均光密度值显著高于对照组(p<0.05)。荧光双标染色结果显示NL1主要在颞叶皮质神经元，且和NMDAR1共表达。免疫印迹结果显示NL1及其受体NRX1β在难治性TLE组中为强阳性，而在对照组中则为弱阳性。难治性TLE患者颞叶皮质的NL1和NRX1β的表达水平显著高于对照组(p<0.05)。2.在LiCl-PILO癫痫大鼠皮质和海马各区，均可见NL1免疫组化阳性染色，其中在海马齿状回、CA1区、CA3区阳性染色最强。在海马组织中，NL1的免疫组化平均OD值在造模后各个时间点呈动态增高趋势。荧光双标染色结果显示NL1在颞叶皮质和海马神经元表达，并且和NMDAR1共表达。免疫印迹结果显示，与对照组相比，NL1和NRX1β在急性期和慢性期均升高，且表达趋势基本一致。与对照组相比，NL1在海马的表达除了在7d和14d组没有差异（p>0.05）外，在其它各组均有差异（p<0.05）。与对照组相比，NRX1β在海马的表达除了在7d组没有差异（p>0.05）外，在其余各组均有差异（p<0.05）。结论：NL1及其受体NRX1β在难治性TLE患者和LiCl-PILO癫痫大鼠颞叶组织中表达均增高，提示其可能参与了TLE的发生与形成过程。第二部分Neuroligin1的knockdown对大鼠癫痫发作的影响目的：为进一步探讨NL1的knockdown是否会对癫痫发作产生影响，我们用沉默NL1基因的短发卡RNA（shRNA）慢病毒减少大鼠海马内源性NL1表达，并在造模后观察由此产生的对癫痫大鼠行为学的影响。方法：1.成年雄性SD大鼠造模前分为三组进行海马立体定位注射：即海马立体定位注射生理盐水假手术组（EP），海马立体定位注射慢病毒空载体组(EP+sh-con.)，以及海马立体定位注射NL1shRNA慢病毒组(EP+sh-NL1)。2.成年雄性SD大鼠海马立体定位注射NL1shRNA慢病毒，并用免疫印迹实验和免疫荧光实验检测其干扰效率.3. LiCl-PILO造模之后60min之内对大鼠进行行为学观察，分别记录每20min时间间隔内的Racine评分，60min之内最大Racine评分，各组在60min之内达到Ⅳ级以上发作的大鼠所占比例，以及大鼠从PILO注射到首次出现Ⅳ级以上发作的时间（癫痫发作潜伏期）。结果：1. NL1shRNA慢病毒海马立体定位注射后，内源性NL1表达逐渐下降。与相应时间点对照组相比，NL1的平均OD比值在慢病毒注射后3d组和7d组中显著下降（p<0.05）。3d组和7d组之间没有显著差异（p>0.05）。在慢病毒注射后的第3d和7d，NL1的总量分别降低了36.3±4.3%和44.2±5.3%。荧光结果显示EGFP阳性表达位于海马，尤其是CA1区。2.在PILO注射后，大鼠癫痫发作的平均Racine评分随着时间的延长逐渐增高。在各20min间隔内，EP+sh-NL1组的癫痫发作评分均比其它组低（p<0.05），组间有差异（p<0.05）而时间与组间交互作用无差异（p>0.05）。EP+sh-NL1组的最大Racine评分比其它组低（p<0.05）,而另外两组对照无差异（p>0.05）。在EP+sh-NL1组中只有33.3%的大鼠出现了Ⅳ级以上的发作，而在其它两组对照组均有83.3%的大鼠出现了Ⅳ级以上的发作。NL1的knockdown能显著降低Ⅳ级以上癫痫的发生率（p<0.05）。与两组对照组相比，EP+sh-NL1组癫痫发作潜伏期显著延长，而两组对照之间无显著差异（p>0.05）。结论：1.对NL1进行的体内shRNA慢病毒干扰能有效抑制内源性NL1的表达，其干扰效率在干扰后第7d达到稳定水平。2.海马内NL1shRNA慢病毒干扰能减轻癫痫发作程度，降低癫痫发作的易感性。第三部分Neuroligin1在大鼠癫痫发作中的作用机制目的：为了研究NL1在自发性癫痫发作（SRS）中的可能作用机制，我们在癫痫大鼠造模后第30d检测NL1shRNA慢病毒干扰效率并进行电生理研究，同时检测与NL1关系密切的NMDAR1在NL1knockdown之后的表达变化。方法：1.癫痫大鼠按海马内立体定位注射试剂不同分为三组：生理盐水组（EP）、空载体组(EP+sh-con.)、NL1shRNA组(EP+sh-NL1)；正常大鼠海马内注射生理盐水作为正常对照组（control）。2.用免疫印迹和免疫荧光实验检测造模后30d大鼠海马NL1shRNA慢病毒干扰效率。3.用全细胞膜片钳技术记录造模后30d各组大鼠脑片海马CA1区细胞的动作电位（AP）、微小兴奋性突触后电流（mEPSC）、诱发兴奋性突触后电流（evoked EPSC）。4.用免疫印迹实验检测造模后30d大鼠海马NMDAR1的总蛋白和膜蛋白。结果：1.免疫印迹实验结果表明，大鼠造模后30d，NL1在海马的表达在EP+sh-NL1组与EP+sh-con.组或EP组之间有显著差异（p<0.05）,而在EP+sh-con.组与EP组之间以及EP+sh-NL1组与control组之间没有显著差异（p>0.05）。 EGFP免疫荧光结果提示慢病毒已成功转染至海马CA1区神经元。2.自发性AP的频率在EP+sh-NL1组显著低于EP+sh-con.组（p<0.05）；与control组相比，AP频率在EP+sh-con.组以及EP+sh-NL1组均显著增高（p<0.05）。mEPSC的幅度在EP+sh-con.组与EP+sh-NL1组之间无差别（p>0.05）；与control组相比，mEPSC的幅度在EP+sh-con.组以及EP+sh-NL1组均显著增高（p<0.05）。mEPSC的频率在EP+sh-NL1组比EP+sh-con.组.显著降低（p<0.05）；与control组相比，mEPSC的频率在EP+sh-con.组以及EP+sh-NL1组均显著增高（p<0.05）；mEPSC的频率在control组和EP+sh-NL1组有显著差异（p>0.05）。3.与control组和EP+sh-con.组相比，EP+sh-NL1组的NMDAR/AMPAR比值显著降低（p<0.05）。与EP+sh-con.组相比，EP+sh-NL1组的NMDAR依赖性EPSCs幅度的显著降低（p<0.05）而AMPAR依赖性EPSCs幅度没有改变（p>0.05）。4.与control组比，EP组和EP+sh-con.组的总蛋白、表面蛋白/总蛋白比值均显著降低（p<0.05）。而EP+sh-NL1组的总蛋白、表面蛋白/总蛋白比值明显低于EP组和EP+sh-con.组（p<0.05）。结论：1.对NL1进行的体内shRNA慢病毒干扰在30d后仍然能有效抑制内源性NL1的表达。2.癫痫大鼠海马NL1的knockdown能抑制海马CA1区神经元的过度兴奋。3.癫痫大鼠海马NL1的knockdown能通过突触后NMDAR1的作用选择性抑制海马脑片NMDAR依赖性突触电流。