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杆状病毒是一类有囊膜的双链DNA病毒,易侵染节肢动物,尤其是昆虫。所以,杆状病毒在控制虫害方面发挥重要作用。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)是一种研究最深入的杆状病毒,被广泛用作生物杀虫剂。目前由于其作为杀虫剂还有一定的局限性,所以研究者利用基因工程的方法来提高其杀虫活性,比如删除不必要的基因、插入抗虫毒素基因等。BmK IT是一种来源于东亚钳蝎的昆虫特异性毒素,本实验室前期构建了AcMNPV-BmK IT(IE1)重组病毒,并发现其能提高p35的转录水平。杆状病毒P35作为抗凋亡蛋白,既可以抑制细胞的凋亡,又能促进病毒的增殖。因此,研究AcMNPV-BmK IT通过调控P35蛋白如何影响宿主凋亡与病毒增殖之间的关系对于分析提高病毒的杀虫活性是至关重要的。而GP64蛋白作为出芽型病毒BV特有的囊膜蛋白,对于病毒的出芽是必需的。之前研究表明由AcMNPV IE1启动子介导表达的BmK IT可以提高病毒的复制,那么研究P35蛋白和GP64的调控关系以及BmK IT是否和如何调控GP64的表达进而影响病毒的增殖就显得尤为重要。本课题在实验室前期工作的基础上,通过三部分实验来研究AcMNPV-BmK IT如何调控P35和GP64从而提高子代病毒的增殖,可为揭示AcMNPV介导表达的BmK IT在细胞和分子水平的抗虫机制提供依据。第一部分:重组病毒AcMNPV-p35-EGFP和AcMNPV-gp64-EGFP的构建。利用Bac to Bac系统将Ac-p35基因与Ac-gp64基因插入中间载体pFastBacDual-EGFP,获得重组质粒pFastBacDual-p35-EGFP和pFastBacDual-gp64-EGFP。再将重组质粒转入DH10Bac感受态,获得重组杆粒Bacmid-p35-EGFP和Bacmid-gp64-EGFP。接着,将重组杆粒Bacmid-p35-EGFP和Bacmid-gp64-EGFP转染Sf9细胞,获得重组病毒颗粒AcMNPV-p35-EGFP和AcMNPV-gp64-EGFP。通过蚀斑实验测定病毒活力,AcMNPV-p35-EGFP的活力为2×106 pfu/ml,而AcMNPV-gp64-EGFP的病毒的活力为1×106 pfu/ml。这为后续研究提供了材料。第二部分:AcMNPV-BmK IT通过调控P35蛋白影响宿主凋亡与病毒增殖之间的互作。本课题组前期实验结果表明AcMNPV-BmK IT(IE1)与AcMNPV相比可提高病毒的复制,并能上调病毒凋亡抑制基因p35的转录水平,那么P35蛋白的上调表达会对宿主细胞产生怎样的影响?这一节我们分析了过表达P35是如何影响宿主凋亡与病毒增殖之间的互作。首先,为分析P35如何影响宿主Sf9细胞关键凋亡蛋白SfP53的表达,我们用AcMNPV和AcMNPV-p35-EGFP侵染Sf9细胞,western blot检测了SfP53的表达情况。结果表明,与对照组相比,AcMNPV-p35-EGFP侵染36 h后能够延缓SfP53的表达,且其表达量在病毒侵染48 h后达到最大,是AcMNPV处理组的1.4倍。由于P53是ATM与ATR最重要的底物之一,那么过表达P35又是如何调控DNA损伤应答?用喜树碱(CPT)、AcMNPV和AcMNPV-p35-EGFP处理Sf9细胞,western blot检测了组蛋白H2AX的磷酸化水平。结果表明,两组病毒处理组均能观察到与喜树碱(CPT)处理组中类似的现象,但是AcMNPV-p35-EGFP处理组在侵染Sf9细胞12-36 h后,H2AX的磷酸化水平明显高于AcMNPV处理组组。为了进一步分析强烈的DNA损伤应答是否与病毒的复制有关,我们检测了gp64基因的转录水平以及子代病毒的生成量。结果表明,与AcMNPV处理组相比,AcMNPV-p35-EGFP能够显著的提高gp64的转录水平,并且在侵染96 h后,转录水平是AcMNPV处理组的39524.60倍。而且较AcMNPV处理组,子代病毒的产量从病毒侵染24 h后开始有显著性变化,直到侵染96 h后,子代病毒的产量提高了25.5%。为了进一步研究过表达P35后病毒与宿主之间的相互关系,用Realtime-PCR检测了P35对病毒凋亡抑制基因iap1/2的影响,结果表明,过表达P35均能提高iap1/2的转录水平,但是更有利于iap1的转录,在病毒侵染96 h后,其转录水平是AcMNPV处理组的47952.18倍。以上结果揭示了AcMNPV-BmK IT通过调控P35来提高子代病毒增殖的机制。第三部分:为了验证上述机制,我们选择受P35调控的重要的病毒囊膜蛋白GP64为研究对象,分析受AcMNPV早、晚期启动子IE1、P10和PH调控的三种病毒AcMNPV-BmK IT(IE1,P10,PH)对GP64的表达进而对病毒增殖的影响。首先,为明确GP64在子代病毒生成中的作用,我们用AcMNPV与AcMNPV-gp64-EGFP处理Sf9细胞,检测子代病毒的生成量,结果表明,AcMNPV-gp64-EGFP侵染Sf9细胞26 h、32 h后,较AcMNPV处理组,子代病毒的生成量分别提高了11.34%、12.69%,这说明GP64是子代病毒囊膜生成过程中关键的蛋白,过表达GP64可提高子代病毒的增殖量。接着,为了分析重组病毒AcMNPV-BmK IT对子代病毒生成关键蛋白GP64定位与表达的影响,用AcMNPV、AcMNPV-BmK IT(IE1,P10,PH)四种病毒侵染细胞6-32 h,免疫荧光分析不同处理组中不同时间点GP64的定位以及积累量,结果表明,在四种病毒侵染6 h后均有GP64的表达,但经IE1启动子调控的BmK IT处理组,提早了GP64蛋白在细胞质的积累并向细胞膜转移,推测有利于病毒的提早出芽。而相较于AcMNPV-BmKIT(IE1)处理组,经P10和PH启动子调控的BmK IT处理组,推迟了GP64在细胞质中的大量积累,但这也为病毒的出芽提供了有利的条件。这些结果说明不同启动子调控表达的BmK IT对GP64的分布以及表达量均有明显的影响。最后,分别用三种重组病毒以及野生型病毒处理Sf9细胞6-32 h,取上清检测子代病毒的生成量,结果经统计学分析表明,三种重组病毒处理组子代病毒的生成量高于野生型病毒处理组,并且经P10调控的BmK IT处理组病毒的生成量要高于经IE1以及PH调控的BmK IT处理组。在病毒侵染细胞32 h后,AcMNPV-BmK IT(P10)处理组中,子代病毒的生成量比AcMNPV、AcMNPV-BmK IT(IE1)、AcMNPV-Bm K IT(PH)处理组分别提高了15.7%、12.3%、10.5%。以上结果证实了AcMNPV介导表达的BmK IT能够促进p35基因的表达,进而促进gp64基因的表达,最终促进子代病毒的增殖。本实验结果可进一步推进基于重组昆虫特异性毒素的AcMNPV病毒感染宿主分子机理的研究,并对提高昆虫杆状病毒杀虫剂活性和科学防治鳞翅目害虫具有重要意义。