肺癌是我国发病率和死亡率最高的癌症,美国每年近23万人次被诊断为肺癌,外科手术是治疗肺癌首选的方法。开胸手术通常伴有中重度的术后疼痛,术后疼痛不仅是影响术后加速康复的核心因素,而且是增加术后并发症和导致慢性疼痛的独立风险因素。文献报道开胸术后慢性疼痛发生率高达30～50%。围手术期推荐采用多模式镇痛来控制术后急性疼痛,从而预防急性疼痛转化为慢性疼痛。近年来,术前口服普瑞巴林被推荐为预防性镇痛措施,其应用在胸科、骨科、乳腺等手术可以降低术后疼痛评分和减少阿片类药物的消耗量。同时,基础研究也提示普瑞巴林可以缓解多种病因所致的神经病理性疼痛。普瑞巴林是Cavα2-δ配体拮抗剂,但是其预防性镇痛的分子生物学机制尚不清楚。手术创伤会立即引起外周神经和脊髓的炎症反应,脊髓背角中神经元细胞会分泌多种促炎症因子,激活胶质细胞,进而释放大量的炎症介质和兴奋性神经递质并可能形成神经元-胶质细胞疼痛调控环路。其中先天免疫系统被认为是调控术后疼痛的重要机制之一,外周和中枢神经敏化可能通过炎性小体NLRP3(Nod-like receptor protein 3)及其产物来驱动外周和中枢神经的敏化。因此,预防性使用普瑞巴林可能抑制手术创伤后导致的先天免疫系统过度激活,减轻脊髓炎症反应从而缓解开胸术后疼痛。本实验拟首先成功建立大鼠开胸术后疼痛模型,然后观察术前预防性使用普瑞巴林对大鼠开胸术后疼痛行为学及脊髓背角中炎性小体NLRP3和下游产物的影响,为临床用药和决策提供理论依据。第一部分:构建大鼠开胸术后疼痛模型目的:构建有效的、稳定的大鼠开胸术后急性和慢性疼痛模型。方法:将48只雄性Sprague-Dawley大鼠均分为4组(n=12),分别是空白对照,假手术A组,假手术B组和开胸组。开胸组大鼠在吸入2.0～3.0%异氟醚诱导后进行气管内插管,确定导管位置后连接小型动物呼吸机进行机械通气。麻醉维持使用1.5～2.0%异氟醚。操作者选择大鼠右侧T4～T5肋间做皮肤至肋间肌切口,暴露胸腔后置入肋骨牵开器分离12 mm并维持60分钟,最后抽出胸腔积气后再逐层缝合肌肉和皮肤。假手术A组大鼠仅在右侧T4～T5肋间切开皮肤、筋膜和分离肋间肌外深层肌肉;假手术B组大鼠在右侧T4～T5肋间做皮肤至肋间肌切口,割开胸膜但不予肋骨牵开操作;麻醉维持60分钟后缝合肌肉和皮肤。空白对照组大鼠仅进行麻醉,不予任何有创操作。手术操作均选择在7:00～15:00 AM时间段内进行。建模前3天和建模后1、2、3、5、7、10、14天,在规定时间段内(9:00～12:00 AM)进行机械痛阈值和冷痛阈值两项疼痛行为学测试。结果:建模前3天四组别间的机械痛、冷痛阈值均无显著性差异。与空白对照组(n=12)、假手术A组(n=12)、假手术B组(n=12)比较,开胸组(n=11)在建模后第1天机械痛阈值降低至最低水平(58.1±4.9g),从术后1天起伤口的机械痛阈值显著下降并持续至术后14天(allP<0.05);同样,从术后1天起冷痛阈值也显著升高并持续至术后14天(allP<0.05)。与空白对照组比较,假手术A组和假手术B组仅在短期内产生机械痛和冷痛阈值下降,术后第3天后已逐渐恢复,尤其是组间冷丙酮反应差异不明显。与其余三组比较,开胸组在术后14天发生显著的机械和冷痛觉过敏,发生率分别为63.6%和45.4%。结论:开胸术后早期的神经病理性因素增加了术后急性疼痛的严重性和持续时间。改良的开胸术后疼痛模型能提供有效的、稳定的术后急性疼痛和慢性疼痛,为研究术后急性疼痛、急性转慢性疼痛提供有效的模型。第二部分:普瑞巴林对大鼠开胸术后疼痛的有效性目的:探索预防性使用不同剂量的普瑞巴林对大鼠开胸术后疼痛模型行为学的影响。方法:将60只雄性Sprague-Dawley大鼠根据术前不同处理措施均分为5组(n=12),分别是空白对照+开胸组,生理盐水+开胸组,普瑞巴林10 mg/kg+开胸组,普瑞巴林30 mg/kg+开胸组,普瑞巴林90 mg/kg+开胸组。建模前每天在19:00～21:00 PM进行灌胃给药(等容量的生理盐水或普瑞巴林),连续3天。开胸手术的操作和第一部分描述的建模方法相同。建模前3天和造模后1、2、3、5、7、14天,在规定时间段内进行机械痛阈值和冷痛阈值两项疼痛行为学测试。结果:建模前3天五组别间的机械痛、冷痛阈值均无显著性差异。高剂量普瑞巴林(90 mg/kg)会明显影响大鼠术后体重增长。与对照组(n=12)、生理盐水组(n=12)比较,普瑞巴林30 mg/kg组(n=1 1)和普瑞巴林90 mg/kg组(n=10)在术后1、2、3、5、7、14天能明显改善机械痛、冷痛觉过敏(allP<0.05)。与普瑞巴林10 mg/kg组(n=12)比较,普瑞巴林30 mg/kg组和普瑞巴林90 mg/kg组的大鼠从术后1～7天伤口机械痛阈值显著升高,冷痛阈值显著降低,然而各组间机械痛、冷痛阈值在术后14天无统计学差异。普瑞巴林30 mg/kg组和普瑞巴林90 mg/kg组的大鼠术后1～14天伤口机械痛阈值、冷痛阈值均无统计学差异。与其余三组比较,普瑞巴林30 mg/kg和普瑞巴林90 mg/kg组的大鼠在术后14天发生慢性疼痛的比率显著降低。结论:不同剂量的普瑞巴林对大鼠基础机械痛和冷痛阈值无明显影响,预防性使用普瑞巴林30 mg/kg或90 mg/kg能较好地抑制开胸术后急性疼痛、降低术后慢性疼痛的发生率,然而高剂量普瑞巴林会明显影响大鼠体重增长。第三部分:普瑞巴林通过抑制脊髓背角中炎性小体的形成发挥抗炎及镇痛作用目的:探索预防性使用普瑞巴林对大鼠开胸术后疼痛模型的脊髓背角中炎性小体NLRP3及其下游产物的影响。方法:将108只雄性Sprague-Dawley大鼠根据不同处理措施分为4组,分别是空白对照组(n=30),开胸组(n=30),生理盐水+开胸组(n=18),普瑞巴林30 mg/kg+开胸组(n=30)。造模前3天空白对照组和开胸组不给予干预处理,余两组分别给予等容量的生理盐水或普瑞巴林灌胃,给药方案、建模方法、行为学测试和第二部分描述相同。术后第1、7、14天,每组随机选取6只大鼠处死并右侧胸段T3～T6脊髓背角取材,以蛋白质印迹法测定炎性小体NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表达;术后第1、7天利用免疫荧光化学方法测定脊髓背角中炎性小体NLRP3、IL-1β的表达和胶质细胞激活情况。结果:建模前和建模后1、3、7、14天机械痛阈值、冷痛阈值变化和第二部分相同,提示开胸术后疼痛模型成功建立。建模术后1、7天开胸手术立即导致大鼠同侧脊髓背角NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表达量明显上调,普瑞巴林能明显抑制同侧脊髓背角中NLRP3及其下游产物的表达量。然而术后14天开胸组、生理盐水组和普瑞巴林组之间无明显统计学意义。建模术后第1天和第7天利用免疫荧光双染技术可见脊髓背角中NLRP3、IL-1β和神经元有共染,其和小胶质细胞、星形胶质细胞无共染,然而开胸手术操作可导致手术同侧脊髓背角中小胶质细胞、星形胶质细胞的荧光强度显著增高,普瑞巴林能明显抑制同侧脊髓背角中小胶质细胞、星形胶质细胞被大量激活。结论:预防性使用普瑞巴林能明显抑制开胸术后早期大鼠脊髓背角神经元炎性小体NLRP3及其下游产物的表达和抑制小胶质细胞、星形胶质细胞被过度激活。因此,预防性使用普瑞巴林参与调控了大鼠开胸术后急性疼痛引起的炎症反应。