研究背景急性髓系白血病(acute myeloid Leukemia,AML)是一类起源于髓系造血干细胞的恶性克隆性疾病,在我国成人白血病中最为多见,且随着年龄增长发病率呈上升趋势。尽管近年来在传统治疗方案如化疗、造血干细胞移植的基础上出现了免疫治疗、分子靶向治疗等新的治疗手法,在一定程度上改善了AML患者的生存和预后,但AML的5年总生存率(overall survival,OS)仍仅30%-40%,而复发和难治患者的更是低于15%,并最终出现耐药,因此有必要寻找新的机制来探索白血病细胞如何逃避化疗药物的杀伤和免疫系统的监视。目前抗肿瘤治疗的基本原理是通过大剂量的化疗或放疗诱导肿瘤细胞凋亡从而清除肿瘤细胞,最新研究发现化疗药物也能诱导肿瘤细胞发生衰老。细胞衰老最初被认为是一种细胞自主的肿瘤抑制机制,可通过引发不可逆的细胞周期停滞,从而阻止具有肿瘤转化风险的受损细胞的增殖。但衰老的肿瘤细胞可能具有可逆性,并可能被诱导出肿瘤干细胞样的活性,而且与凋亡细胞不同的是,衰老细胞可以存活一段时间并具有代谢活性,可以通过分泌细胞外基质降解酶、细胞因子、趋化因子等所构成的衰老相关的分泌表型(SASP)影响肿瘤微环境和相邻的细胞,并有助于慢性炎症和肿瘤发生,SASP还可以通过吸引免疫细胞以清除病变或衰老的肿瘤细胞,但当衰老的细胞未能适当清除并出现持续积累时,则可能通过旁分泌的形式作用于周围免疫细胞,促进其向抑制性转化,从而介导了肿瘤的免疫逃逸。这些作用可能促成了肿瘤的复发、转移以及对化疗、靶向及免疫治疗的无反应,因此可以从衰老和凋亡的角度去研究AML的复发和耐药。“SENEX”基因于2004年被成功克隆,该基因编码的蛋白具有RhoGAP决定簇。Paul R.Coleman等最早通过对血管内皮细胞的研究发现SENEX基因可以通过p16INK4A/Rb途径的激活诱导应激性早衰来拮抗TNF-α诱导的人血管内皮细胞凋亡,但不会影响端粒长度并且不会在衰老内皮细胞中出现复制性衰老基因谱。提示该基因可以通过调节一些相关基因的转录,从而在控制细胞周期及衰老和凋亡的信号转导途径中发挥重要作用。除此之外,我们课题组前期通过对膀胱癌患者CD4~+CD25~+Treg细胞(简称Treg细胞)的研究表明,Treg细胞中高表达的SENEX基因与其凋亡抵抗的能力有关,可以特异性保护H2O2诱导的Treg细胞凋亡,然而尚不清楚SENEX基因在AML患者中的表达情况,以及是否在诱导白血病细胞衰老及抗凋亡中起作用。本研究中共入组了67例AML患者,包括首次诊断的患者21例,经过诱导化疗后达到细胞学缓解的患者27例,缓解后首次复发的患者19例。同时按照年龄、性别相匹配的原则,选取12例缺铁性贫血患者作为对照组。然后对SENEX在各组骨髓单个核细胞中的表达及其与临床及疗效的关系进行了相关分析,其后又进一步通过体外干预SENEX的表达进而研究不同时间段AML细胞株衰老和凋亡的变化,最后临床随访了一例复发的AML患者,并观察其在化疗期间SENEX基因及衰老和凋亡的改变情况。具体具具方法和具具具具如具:(1)通过Real-time PCR和western blot方法从基因及蛋白水平上检测了缺铁性贫血对照组以及初诊、缓解、复发不同疾病阶段的AML患者骨髓单个核细胞中SENEX基因的mRNA及蛋白的表达情况,具具表明,与对照组(0.92±0.51)相比,初诊AML患者骨髓中SENEX基因mRNA的表达水平(4.06±2.72)明显升高,并具有统计学差异(P=0.001),并且在治疗达到缓解后水平具降(2.52±1.83),而当疾病复发时SENEX的表达再度升高(3.27±2.54)。而从蛋白水平对各组患者进行分析比较时,也发现了同样的趋势,由此可见,在AML患者体内存在着SENEX的高表达,并且与AML疾病发生发展是密切相关的。(2)分析SENEX基因表达水平与AML患者临床特征及疗效的关系,具具表明:SENEX基因在AML各亚型中表达不一,其中以M3亚型表达量最高;而与低中危组(3.13±2.14)比较,SENEX在高危组(4.97±3.67)中表达量最高。在首次行蒽环类联合阿糖胞苷化疗后,未缓解患者SENEX基因表达水平(4.85±2.20)明显高于缓解患者(1.77±1.47),且具有统计学差异(P=0.003),而在不同年龄段、性别、白细胞计数方面则无明显统计学差异。同时,AML患者SENEX基因mRNA表达水平与骨髓原始细胞正相关。由此推测,SENEX可以作为预测疗效及预后的指标;(3)为进一步研究SENEX的功能,体外培养M3细胞株NB4细胞,使用小剂量细胞毒药物阿糖胞苷(Ara-c)(10μM)应激损伤成功的诱导了NB4细胞衰老模型,并通过Real time-PCR检测衰老细胞中SENEX mRNA的表达情况,具具表明与对照组(1.04±0.2)相比,小剂量Ara-C诱导组SENEX mRNA表达水平显著升高(8.50±1.4,P<0.01),提示小剂量Ara-C能诱导NB4细胞株中SENEX基因表达上调。使用脂质体Lipofectainin?2000将NC和SENEX-SiRNA转入NB4细胞中,与NC组(2.78±0.9)相比,SENEX-SiRNA组SENEX mRNA水平(1.36±0.6)降低。而在小剂量Ara-C压力具,SENEX-SiRNA+Ara-C组SENEX mRNA表达水平(1.12±0.5)则显著低于NC+Ara-C组(6.24±1.1)和Ara-C组(8.50±1.4),12h检测细胞衰老情况,可以观察到Ara-C压力具,沉默SENEX的组别衰老细胞数显著减少,这些具具提示了小剂量Ara-C可以在体外诱导NB4细胞衰老,且衰老细胞中SENEX mRNA表达水平显著增高,其次,沉默SENEX表达会显著影响小剂量Ara-C引起的应激性早衰;(4)为了研究SENEX差异性表达所带来的细胞衰老及凋亡的改变,分别在阿糖胞苷作用12小时及48小时后通过β-半乳糖苷酶染色以及AnnexinV/PI双染法研究了各组衰老及凋亡细胞比例的变化,具具表明:SENEX自然表达的细胞在12小时内发生衰老的细胞比例较高,在48小时时细胞凋亡的比例相对较低。而通过siRNA抑制SENEX基因的表达后,这些SENEX沉默的细胞在12小时内发生衰老的比例较低,而在48小时细胞凋亡的比例明显升高。由此推测,SENEX基因可以通过诱导NB4细胞衰老并拮抗细胞凋亡,进而发挥保护白血病细胞的作用。(5)用同样的具具方法,我们观察了一例临床复发AML患者在小剂量化疗前后细胞衰老、凋亡及SENEX基因表达的改变,具具表明,在100mg Ara-C预处理2天后,高达52%的外周血单个核细胞出现典型的衰老改变。同时,外周血单个核细胞中早期及晚期凋亡的细胞比例较预处理前也明显上升,同时SENEX mRNA水平也上调4倍(5.2%Vs.1.0%),提示SENEX在机体内也可以促进AML细胞衰老的作用。更重要的是,通过后期随访观察,该患者在达到缓解状态后,SENX基因表达一直处于较低水平,且在外周血及骨髓中均未发现衰老细胞。总的来说,本研究表明了SENEX在初诊和复发的AML患者中表达均明显上调,而在治疗后完全缓解患者中则明显降低,不同亚型AML患者中SENEX基因表达水平不同,以M3表达量最高;其次,在体外具具中,我们使用小剂量Ara-C成功诱导了M3细胞株NB4细胞衰老且证明了衰老细胞中SENEX表达显著增高,当沉默SENEX后诱导衰老细胞则显著减少,提示SENEX是小剂量Ara-C诱导NB4细胞衰老中的关键分子;进一步研究发现,SENEX的这种作用可能与压力诱导的应激性早衰(SIPS)能够介导AML细胞凋亡抵抗有关,这些具具提示SENEX有可能作为疾病分层诊断和评估疗效的有效指标之一,而SENEX基因在AML发病发展中的确切分子机制还有待进一步更深入的研究。