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目的:研究1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)后适应是如何影响自噬来对抗H9c2心肌细胞的H/R损伤,从而起保护作用的。并探讨其与AMPK和m TOR通路的关系。方法:1.H9c2心肌细胞的培养及H/R模型的建立将H9c2大鼠心肌细胞株从液氮罐中取出进行复苏,按常规贴壁细胞培养方法接种于含血清的DMEM培养基中,放于37o C、5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。2到3天换液并传代一次。24h后,将细胞分组编号,除正常组外的其余六组连接含95%N2、5%CO2的缺氧罐进行缺氧处理,缺氧16h。16h后,将缺氧液换成不含血清的DMEM培养基,给予不同条件处理板中细胞,复氧条件下培养4h。2.细胞分组(1)正常对照组:不缺氧,仅将完全培基换成不含有血清的DMEM培养基培养4h;(2)缺氧/复氧模型组:将完全培基更换为缺氧液在缺氧装置中培养16h,然后换成不含有血清的DMEM培养基复氧培养4h;(3)S1P组:缺氧16h,同H/R组。复氧前加入含终浓度为4μM的S1P的DMEM培氧基复氧培养4h;(4)S1P+3-MA组:缺氧16h,同H/R组。复氧时换成终浓度为10m M的3-MA(自噬抑制剂)以及4μM的S1P的DMEM培养基复氧培养4h;(5)3-MA组:缺氧16h,同H/R组。3-MA组在复氧时加入含终浓度为10m M的3-MA的DMEM培氧基复氧培养4h;(6)S1P+RAPA组:缺氧16h,同H/R组。S1P+RAPA组在复氧时换成终浓度为500n M的RAPA(自噬诱导剂)及4μM的S1P的DMEM培养基复氧培养4h;(7)RAPA组:缺氧16h,同H/R组。RAPA组在复氧时加入含终浓度为500n M的RAPA的培养基复氧培养4h。3.探讨S1P、3-MA、RAPA对缺氧/复氧损伤心肌细胞存活率的影响MTT法测定各组细胞存活率,确定S1P后适应对心肌细胞H/R损伤的保护作用。4.探讨S1P、3-MA、RAPA对缺氧/复氧损伤心肌细胞培养液LDH活性的影响测定各组细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力,以此反映心肌损伤情况。5.探讨S1P后适应对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用与自噬的关系。Western Blot法测定心肌细胞自噬相关标志分子(LC3-II/LC3-I、Beclin-1、LAMP-2)的蛋白水平。观察S1P对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤自噬变化的影响。6.探讨S1P对自噬的影响与AMPK/m TOR信号通路的关系。采用WB技术观察AMPK和m TOR的磷酸化变化,以明确S1P对自噬的影响是否与AMPK以及m TOR有关。7.探讨抑制自噬或诱导自噬对S1P抗心肌细胞缺氧复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响。使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率。结果:1.MTT测定细胞存活率正常对照组细胞存活率较高,缺氧复氧模型组相对于正常对照组细胞存活率显著降低,S1P组相对缺氧复氧模型组细胞存活率明显升高,S1P+RAPA组相对于S1P组细胞存活率有所下降,自噬诱导剂RAPA可部分抵消S1P抗缺氧复氧损伤作用。2.测定细胞培养液中LDH活力正常对照组中,LDH活力较低。与正常组相比,缺氧复氧模型组的LDH活力明显增加。相较于缺氧复氧模型组,S1P组的LDH活力明显降低。单用自噬抑制剂3-MA亦可降低LDH活力,S1P+3-MA组的LDH活力相较于S1P组明显降低。RAPA可升高LDH活性,S1P+RAPA组的LDH活力相较于S1P组明显增加,RAPA的预处理可抑制S1P对LDH活力的降低作用。3.S1P对自噬相关标志分子(Beclin-1、LC3、LAMP-2)蛋白表达的影响Western Blot方法检测LC3蛋白表达结果显示,正常对照组LC3-Ⅰ水平较高,而LC3-Ⅱ水平较低。经缺氧复氧处理,LC3-Ⅱ水平明显增高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上升。与缺氧复氧组相比,S1P组的LC3-Ⅱ水平较低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低。单用自噬诱导剂RAPA可轻度升高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ。RAPA可抑制S1P降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的作用。Western Blot方法检测Beclin-1蛋白表达结果显示:正常对照组心肌细胞的Beclin-1表达水平较低,与正常对照组相比,缺氧复氧模型组的Beclin-1的蛋白水平的表达明显增加;与缺氧复氧模型组相比,S1P组的Beclin-1的蛋白表达明显降低;与S1P组相比,S1P+RAPA组的Beclin-1的蛋白水平的表达增加,S1P降低Beclin-1蛋白表达的作用明显被RAPA所抑制。Western Blot方法检测LAMP-2蛋白表达结果显示:正常对照组心肌细胞的LAMP-2表达水平较高,与正常对照组相比,缺氧复氧模型组的LAMP-2蛋白水平的表达明显降低;与缺氧复氧模型组相比,S1P组的LAMP-2的蛋白表达明显增加。与S1P组相比,S1P+RAPA组的LAMP-2蛋白表达明显降低,提示RAPA可抑制S1P升高LAMP-2蛋白表达的作用。4.S1P对AMPK、m TOR蛋白的磷酸化表达的影响AMPK Western blot检测结果显示,各组t-AMPK蛋白水平无显著差异,正常对照组的p-AMPK水平较低,缺氧复氧组中p-AMPK的表达明显增高,S1P、RAPA对缺氧复氧引起的p-AMPK增多无明显影响。m TOR的蛋白检测显示,各组t-m TOR水平无明显差异。与正常组相比,H/R组的p-m TOR的蛋白表达明显降低,S1P可明显上调心肌细胞的p-m TOR蛋白表达。RAPA组的p-m TOR蛋白表达明显降低,RAPA可抑制S1P上调p-m TOR水平的作用。5.流式细胞仪检测各组细胞凋亡率正常组细胞的凋亡率较低,与正常组相比,H/R组细胞凋亡率明显增加;而S1P组的细胞凋亡率相较于H/R组显著降低;RAPA对细胞凋亡无明显影响,但可抑制S1P降低细胞凋亡率的作用。结论:1.S1P可通过调控自噬发挥抗心肌细胞缺氧复氧损伤作用、抗心肌细胞凋亡作用。2.S1P自噬调控作用与促进m TOR磷酸化有关,而与AMPK磷酸化无关。