神经胶质瘤(glioma)是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,其占中枢神经系统肿瘤的30%和全部恶性颅内肿瘤的80%。神经胶质瘤多来源于少突胶质细胞,星形胶质细胞以及室管膜。神经胶质瘤病理类型包括少突胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、以及星形胶质细胞瘤等。由于肿瘤细胞的增殖及瘤体积的增大,压迫中枢神经并引起颅内压升高,导致极高的致死率。目前神经胶质瘤的治疗手段多为外科手术结合化疗和放疗的联合疗法。外科手术最为有效,但其对正常脑组织的损伤也最为严重。同时,多数神经胶质瘤呈浸润性生长,外科手术无法将其完全切除,因而其术后复发率很高。放疗对神经胶质瘤的作用有限,往往作为辅助手段,由于血脑屏障的存在,限制了很多化疗药物的应用。因此,深入研究神经胶质瘤的分子发病机理,寻找其发生发展密切相关的信号通路及其关键分子靶点,对于早期防治及其开拓神经胶质瘤治疗的新途径至关重要。SPOCK1是编码基质细胞糖蛋白家族的成员,它们均隶属于BM-40/SPARC/骨粘连蛋白家族,它的分子结构特点说明它可以作为一种黏附蛋白,不仅能够参与细胞基质与细胞表面的相互作用,而且能够参与细胞形态改变、参与细胞增殖及迁移过程,因而在物种生存中发挥重要作用。近年来的研究发现,SPOCK1在肝癌、肺癌、前列腺癌、胆囊癌、卵巢癌等恶性肿瘤组织中出现过度表达的现象,并与其病理分型及恶化程度呈正相关,揭示了SPOCK1与肿瘤的发生、发展有着密切联系。最近的一项研究表明SPOCK1在多型性胶质母细胞瘤和纤维型星形细胞瘤组织中高表达,说明SPOCK1基因在神经胶质瘤的发生与发展过程中可能发挥重要作用。然而,SPOCK1对人神经胶质瘤细胞生物学功能改变的影响,以及其潜在的发生机制国内外仅有1篇文献报道。本研究在国内外研究进展基础上,通过基因工程重组技术在人神经胶质瘤细胞内沉默SPOCK1基因以及过表达SPOCK1基因等,系统评价SPOCK1基因对人神经胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响,并进一步研究SPOCK1基因对PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号转导通路的作用,从而探讨SPOCK1与神经胶质瘤发生、发展之间的作用及其涉及的信号通路与分子靶点。本研究主要取得以下学术进展:1.分别成功构建了SPOCK1基因沉默及过表达载体,为研究SPOCK1在神经胶质瘤发生发展中的作用奠定了实验基础。根据SPOCK1基因序列设计靶向抑制该基因表达sh RNA序列,并在体外人工合成,通过脂质体转入SPOCK1基因高表达的U87MG细胞株。将过表达质粒稳定转染至SPOCK1低表达的U251细胞株,转染细胞通过G418进行稳定筛选,应用实时荧光定量PCR与Western blot检测SPOCK1基因的干扰效率。其检测结果显示稳定转染sh RNA的U87MG细胞株的SPOCK1基因在m RNA以及蛋白水平表达受到抑制,稳定转染过表达质粒的U251细胞株的SPOCK1基因在m RNA以及蛋白水平表达升高,与对照组相比具有显著性差异。2.证实了沉默SPOCK1基因显著抑制人神经胶质瘤细胞的增殖,而SPOCK1基因过表达则显著促进人神经胶质瘤细胞的增殖。我们利用稳定转染的细胞株,通过CCK8方法检测各组细胞的增殖情况,发现SPOCK1基因沉默后明显抑制U87MG细胞株的细胞增殖,当SPOCK1基因表达上调后明显增强U251细胞株的增殖能力。为了更好的反映细胞的增殖能力,我们利用平板克隆形成实验,对各组中形成的单克隆细胞群计数,在接种细胞数的基础上,计算克隆形成率,实验结果提示SPOCK1基因沉默后明显抑制U87MG细胞株的克隆形成能力,SPOCK1基因表达上调后U251细胞株的克隆形成能力增强。通过流式细胞技术检测各组细胞在不同细胞周期的细胞比例,结果提示SPOCK1基因沉默后,G1期细胞比例明显增多,在G2/M期,细胞比例显著减少。在过表达SPOCK1基因组,G1期的细胞比例减少,G2/M期细胞比例显著增多。通过免疫荧光测定技术检测增殖细胞核抗原(PCNA)的分析结果进一步提示SPOCK1基因沉默引起PCNA荧光强度减弱,而SPOCK1基因过表达引起PCNA荧光强度增强,提示SPOCK1基因通过上调PCNA的表达促进神经胶质瘤细胞的增殖。3.证实了沉默SPOCK1基因可显著促进人神经胶质瘤细胞的凋亡,而SPOCK1基因过表达则显著抑制人神经胶质瘤细胞的凋亡。分别将SPOCK1基因沉默载体与过表达稳定转染神经胶质瘤细胞株,通过流式细胞仪分析各组细胞凋亡间的差异,Hoechst染色观察凋亡细胞的细胞核,分析结果显示SPOCK1基因表达受抑制的U87MG组细胞株发生了明显的细胞凋亡,而SPOCK1基因过表达的U251细胞株的细胞凋亡明显受到抑制。为了进一步验证SPOCK1对细胞凋亡的影响,我们通过Western blot方法检测细胞凋亡相关蛋白的表达,研究结果显示SPOCK1基因表达下调后抑制了Bcl-2的表达,促进了Bax,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达.反之,SPOCK1基因表达上调促进了Bcl-2的表达,抑制了Bax,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达,提出了SPOCK1通过影响多种凋亡关键蛋白的表达抑制神经胶质瘤细胞凋亡的分子机制。4.证实了SPOCK1基因沉默后人神经胶质瘤细胞迁移、侵袭能力显著减低,而SPOCK1基因过表达人神经胶质瘤细胞迁移、侵袭显著增强。为了研究SPOCK1基因对人神经胶质瘤细胞迁移、侵袭的影响,我们首先通过划痕实验观察各组细胞的迁移能力,分别观察0h,12h,24h各组间差别,测量宽度缩小的比例区别计算迁移能力差异,研究结果显示在SPOCK1基因表达下调的U87MG组细胞株迁移能力明显受到抑制,而在SPOCK1基因表上调的U251组细胞株中细胞的迁移能力明显增强。随后,我们通过Transwell小室实验观察各组细胞的侵袭能力,研究结果表明SPOCK1基因表达上调促进人神经胶质瘤细胞的侵袭,SPOCK1表达下调抑制人神经胶质瘤细胞的侵袭。为进一步确定SPOCK1基因对神经胶质瘤细胞转移能力的影响,通过明胶酶谱及Western blot实验检测MMP2,MMP9的活性及蛋白表达,结果表明U87MG组细胞中MMP2和MMP9的活性和表达受到了SPOCK1基因表达下调的抑制,而U251组中SPOCK1基因表达上调促进了MMP2和MMP9的活性和表达,率先阐述了SPOCK1基因过表达促进神经胶质瘤细胞迁移、侵袭的分子机理与相关的分子靶点。5.证实了SPOCK1基因通过调控PI3K/AKT及Wnt/β-catenin信号转导通路影响神经胶质瘤细胞株的生物学功能。为了进一步探讨SPOCK1基因对神经胶质瘤细胞作用的分子发病机制,我们首先通过Western blot检测PI3K/AKT通路相关蛋白表达,结果显示SPOCK1基因沉默后p-PI3K,p-AKT蛋白表达水平下调,相反,SPOCK1基因表达上调,促进p-PI3K,p-AKT蛋白表达。鉴于Wnt/β-catenin信号转导通路在神经胶质瘤发生和发展中同样发挥着重要作用,因此我们利用Western blot检测Wnt1和β-catenin的表达水平并同时检测了其下游靶基因c-MYC和Cyclin D1的蛋白表达,研究结果表明SPOCK1基因沉默后,Wnt1,β-catenin、c-MYC、Cyclin D1的蛋白表达水平随之下调,相反,SPOCK1基因表达上调,促进Wnt1,β-catenin、c-MYC、Cyclin D1的蛋白表达。进一步证实了SPOCK1基因通过PI3K/AKT、Wnt/β-catenin信号通路及其关键分子靶点促进神经胶质瘤细胞的增殖。综合上述研究得到以下结论:本研究通过使SPOCK1基因沉默及过表达两个方面证实SPOCK1基因对人神经胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。初步探讨了SPOCK1基因可能通过调控PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号通路影响神经胶质瘤细胞株的生物学功能。研究结果说明SPOCK1基因起到了促肿瘤发生的作用,有望成为神经胶质瘤治疗的新靶点。