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研究目的:本研究旨在阐明清肺承气汤治疗腹腔感染所致ARDS患者的潜在分子机制。首先通过多中心临床数据分析初步表明清肺承气汤在临床治疗中的明确治疗效果。进一步通过构建清肺承气汤治疗ARDS的网络药理学模型,对明确的治疗效果进行潜在基因靶点和信号通路的相关性评估;最后通过构建腹腔感染所致ARDS大鼠的模型,筛选清肺承气汤治疗腹腔感染所致ARDS的差异microRNA,对差异microRNA进行下游基因靶点和信号通路评估,交叉分析得到潜在分子机制。研究方法:第一部分清肺承气汤对急性腹腔感染所致ARDS患者保护机制的多中心研究从四所三甲医院选取27例腹腔感染所致ARDS患者并记录患者一般情况,随机分为14例基础治疗加清肺承气汤治疗和13例基础治疗加大承气汤对照治疗,在治疗前和治疗3天取两次肺泡灌洗液,微球检测法检测比较2组治疗前后IL-4、IL-6、IL-10分泌情况,流式细胞术分析两组患者肺泡巨噬细胞凋亡比例。第二部分清肺承气汤治疗急性呼吸窘迫综合征的网络药理学分析通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)数据库检索清肺承气汤中的化学成分和靶点,与Gene Cards数据库和OMIM数据库的ARDS靶点交叉比对得到药物-疾病靶点,然后用Cytoscape3.7.1软件建立“化合物-预测靶点”网络、预测靶点间的蛋白相互作用(PPI)网络,预测靶点的KEGG富集分析,结合第一部分的临床结果评估清肺承气汤治疗ARDS的可能基因靶点和信号通路。第三部分清肺承气汤对腹腔感染所致ARDS大鼠的基因组学研究通过盲肠结扎术(CLP)制造腹腔感染构建ARDS大鼠模型20只,随机数字法将大鼠模型分为对照组(n=10)和中药治疗组(n=10),治疗3天后两组各选3只大鼠取肺部组织,进行HE染色,并通过高通量基因芯片法筛选差异microRNA,通过GO数据库和KEGG数据库对差异microRNA下游基因进行GO和KEGG分析,与第二部分结果进行交叉分析。研究结果:第一部分清肺承气汤对急性腹腔感染所致ARDS患者保护机制的多中心研究1.患者的一般资料:两组患者一般情况差异无统计学意义。2.两组患者肺泡巨噬细胞凋亡比较:治疗前两组无统计学意义(P>0.05),治疗后,两组肺泡巨噬细胞凋亡比例有明显的差异(均P<0.05),通过治疗前后差值统计,治疗组细胞凋亡面积明显下降(P<0.05)。3.两组患者肺泡信号因子比较:治疗前两组之间3组细胞因子水平无显著差异(P>0.05),而治疗后3组细胞因子在治疗组和对照组之间存在差异(P<0.05),治疗组IL-6分泌量经过中药治疗后显著上升(P<0.05),而IL-10的分泌量呈下降趋势(P<0.05),IL-4有一定下降趋势,但P>0.05代表下降趋势不显著。第二部分清肺承气汤治疗急性呼吸窘迫综合征的网络药理学分析1.药物活性化合物筛选:总共筛选出78个化合物,其中大黄16种,枳实22种,厚朴2种,黄连14种,半夏13种,瓜蒌11种。2.清肺承气汤治疗ARDS潜在靶点筛选:获得ARDS相关基因靶点476个,筛选清肺承气汤活性化合物对应靶点225个,将疾病和药物靶点进行交叉筛选获得共同潜在靶点63个。3.清肺承气汤治疗ARDS的“化合物—预测靶点”复合网络图:根据清肺承气汤包含活性化合物和其对应的靶点以及ARDS潜在靶点共同构建了一个网络图,网络图由110个节点(44个化合物节点和63个基因靶点)和324个边缘组成。quercetin(檞皮素)是相关度值第一的化合物,BCL2、ESR1、AR分别与7种、16种、19种化合物相结合,它们在细胞增殖、炎症、细胞凋亡等方面起到关键作用。4.清肺承气汤治疗ARDS潜在靶点的PPI网络图:使用String数据库对63个疾病-药物潜在靶点构建PPI网络图,PPI图具有68个节点和1078条边,PPI图相关度值最高的是IL-6。5.潜在靶点的KEGG通路分析:对63种清肺承气汤治疗ARDS的潜在靶点进行KEGG通路统计,63种潜在靶点映射到78条KEGG通路种,TNF通路、NF-κB通路和T细胞受体通路属于排名靠前的信号通路。第三部分清肺承气汤对腹腔感染所致ARDS大鼠的基因组学研究1..microRNA的筛选:筛选后得到16组符合条件有明显差异的microRNA,包括rno-mi R-338-5p、rno-mi R-20a-5p、rno-mi R-350、rno-mi R-199a-5p、rno-mi R-218a-1-3p、rno-mi R-224-5p、rno-mi R-362-3p、rno-mi R-678、rno-mi R-3584-5p、rno-mi R-1839-5p、rno-mi R-6216、rno-mir-15b、rno-mir-27b、rno-mir-30c-1、rno-mir-320、rno-mir-665。清肺承气汤通过分别增强或者抑制这16条microRNA的表达来调控机体的反应性。2.清肺承气汤对腹腔感染所致ARDS大鼠的病理影响:相较于对照组,中药治疗组肺组织HE染色提示:肺泡大小较均一,肺内出血情况、炎性细胞浸润、肺泡间隔增厚、间质水肿均明显减轻。3.microRNA的GO和KEGG分析:KEGG分析得到Wnt signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、Protein processing in endoplasmic reticulum、Gn RH signaling pathway、Erb B signaling pathway属于直接或者间接干预凋亡作用的通路,而T cell receptor signaling pathway、p53 signaling pathway属于免疫调节方面的关键通路。GO分析得到清肺承气汤的生物活动主要集中在IL-12分泌和细胞电活动;细胞成分方面主要集中在参与基因组装、细胞膜的组成、囊泡膜的形成、髓鞘鞘轴突区的形成;在分子功能方面集中在病毒的结合、受体抑制剂的活性、乙酰胆碱受体的结合。研究结论综上所述,通过多中心临床数据、网络药理学模型评估以及动物实验,本实验初步探究了清肺承气汤治疗腹腔感染所致ARDS的潜在分子机制,在肺巨噬细胞的凋亡方面,清肺承气汤通过microRNA-20a-BCL2轴系以及microRNA-350-JNK轴系进行调控;炎症调控方面,清肺承气汤通过microRNA-350和microRNA-20a-5p调控IL-6、IL-10、AR、CXCL8、PPARγ以及其映射的白细胞介素家族通路和NF-κB通路以及TNF通路来影响炎症反应。