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目的:常染色体显性多囊肾病(ADPKD)是一种常见的遗传性肾脏疾病,发病率约为1/1000,以双侧肾脏发生多个囊肿且进行性增大为主要特征,最终导致肾功能衰竭。由于ADPKD发病率高,预后差,尚无有效治疗方法,因此,阐明ADPKD发病的分子机制,对高风险人群进行症状前诊断和遗传咨询,避免患儿出生,具有重要的理论和实践意义。ADPKD表现出明显的遗传异质性,16号染色体PKD1基因突变(约占85%)和4号染色体PKD2基因突变(约占15%)均可导致ADPKD。但由于涉及的外显子数目多、无突变热点、基因组内存在复制区域、部分区域GC含量高等原因,ADPKD突变检测面临困难与挑战。ADPKD外显率高,表现为延迟显性,很多患者在疾病确诊时已经结婚生子,将致病基因遗传给下一代而使后代发病几率高达50%,因此,开展胚胎植入前遗传学诊断(PGD)有利于疾病的早期预防、早期干预。PGD是基于单个细胞的遗传学分析,样本量是制约PGD的瓶颈。多重置换扩增(MDA)、多次退火环状循环扩增(MALBAC)等全基因组扩增(WGA)技术能够以最小的扩增偏倚扩增整个基因组序列,为后续的遗传分析提供足量的DNA模板。但等位基因脱扣、优势扩增等造成的假阳性和/或假阴性,影响PGD的准确性。利用短串联重复或单核苷酸多态位点(SNP)进行连锁分析能够减少上述问题引起的漏诊、误诊。近年来,高通量测序技术日臻成熟,不仅可以在全基因组范围内进行非整倍体筛查,还能够检测单个核苷酸变异,因而在遗传病基因检测和PGD领域得到广泛应用。本研究以两个ADPKD家系为切入点,明确家系致病基因突变位点,建立ADPKD胚胎植入前遗传学诊断平台,旨在丰富ADPKD突变数据库,满足ADPKD胚胎植入前遗传学诊断的需要,为未来疾病精准医疗提供有用线索,具有一定的理论价值和临床意义。研究方法:两个ADPKD家系33名成员(包括14名ADPKD患者和19名正常个体)由大连市妇女儿童医疗中心生殖与遗传中心提供。常规提取先证者基因组DNA,利用超声波仪将基因组DNA打断成200250bp的片段,经AMPure Beads纯化、末端修复、连接和富集完成DNA建库,与定制的基因捕获芯片杂交(47℃6472h),捕获目标序列。利用高通量测序仪Illumina HiSeq2500 Analyzer连续双向测序90个循环,Illumina Pipeline software读出原始测序数据,去除低质量和被接头污染的序列,与人类基因组数据进行序列比对,鉴定致病突变。PCR结合Sanger测序、共分离分析验证致病突变,生物信息学软件预测突变功能。在PGD前,对比MDA和MALBAC的扩增均一性和等位基因脱扣率,优化单细胞WGA方案;利用废弃胚胎进行不同深度高通量测序,筛选适合胚胎非整倍体筛查的最佳测序深度。对拟进行辅助生殖治疗的先证者夫妇分别进行控制性超排卵和睾丸取精术,行卵胞浆内单精子注射完成受精,胚胎在体外培养至囊胚期进行活检。取滋养层细胞,应用MALBAC技术进行单细胞WGA。在致病突变上、下游3Mb范围内选择能够提供信息的6个SNP位点,以WGA产物为模板,常规PCR分别扩增致病突变位点和SNP位点。PCR扩增产物与WGA扩增产物等质量比混合,高通量测序检测基因组拷贝数变异(CNV)和SNP,Sanger测序检测致病突变位点,SNP连锁分析鉴定与致病基因连锁的单体型。结果:1.目标序列捕获-高通量测序结果显示:家系1先证者PKD1基因第15外显子存在一个新的c.6491C>A突变,家系2先证者PKD1基因第46外显子存在一个已知的c.1260812635del突变。2.Sanger测序证实:家系1先证者在c.6491处存在C?A的颠换,且为杂合突变,与高通量测序结果一致;家系2先证者在c.1260812635处存在28bp缺失,缺失序列为5’-GGCTGGGGACAAGGTGTGAGCCTGAGCC-3’,且为杂合突变,与高通量测序结果一致。3.家系1的9名患者均携带c.6491C>A杂合突变,而11名正常个体未携带c.6491C>A突变。家系2的5名患者均携带c.1260812635del杂合突变,而8名正常个体未携带c.1260812635del突变。PKD1基因新突变c.6491C>A和已知突变c.1260812635del在ADPKD家系与疾病表型共分离。4.生物信息学分析显示:致病突变位点c.6491和c.1260812635对应的蛋白质序列在人类、恒河猴、小鼠等不同物种之间表现出高度的进化保守性。c.6491C>A突变预测形成一个比野生型PKD1蛋白缺少2140个氨基酸残基的截短蛋白。因此,PKD1基因新突变c.6491C>A为无义突变,命名为p.Ser2164Ter。c.1260812635del突变导致缺失点以后阅读框发生改变,预测形成一个比野生型PKD1蛋白增加44个氨基酸残基的突变型PKD1蛋白。因此,PKD1基因已知突变c.1260812635del为移码突变,命名为p.Arg4203Profs*146。5.MALBAC的覆盖度(90%)优于MDA的覆盖度(70%),而MALBAC的等位基因脱扣率(13%)低于MDA的等位基因脱扣率(40%),提示采用MALBAC进行单细胞全基因组扩增优于MDA。6.22个常规高通量测序(平均测序数据量为1.0M PE reads)提示存在CNV异常的胚胎,经过深度高通量重测序(平均测序数据量为3.5M PE reads),检测出9个核型正常的胚胎。基于不同测序数据量(0.3M、0.6M、1.5M和3.5M PE reads)的随机抽样结果显示:对于1Mb10Mb长度的CNV来说,随着测序数据量的增加,CNV检测的假阳性率显著降低。上述结果提示测序深度的增加能够显著提高胚胎植入前非整倍体筛查的准确性。7.PGD前对家系1的关键成员(II1、II2、III1和III2)进行Sanger测序,证实:先证者(III2)及其母亲(II2)携带c.6491C>A(p.Ser2164Ter)杂合突变,先证者配偶(III1)及先证者父亲(II1)未携带c.6491C>A(p.Ser2164Ter)突变,先证者(III2)的致病突变来自其母亲(II2)。8.通过控制性超促排卵获得11个减数分裂II中期卵子,经卵胞浆内单精子注射进行体外受精,获得5枚可供活检级别的囊胚(分别命名为Embryo 1、Embryo 2、Embryo 3、Embryo 4和Embryo 5),并成功进行囊胚活检和全基因组扩增。9.Sanger测序显示Embryo 2和Embryo 5携带c.6491C>A(p.Ser2164Ter)杂合突变,不适合胚胎移植;SNP连锁分析显示Embryo 2和Embryo 5获得从父方传递的、与致病基因连锁的单体型CCGAAC,不适合胚胎移植;CNV检测显示Embryo1(46,XN/47,XN,+9)和Embryo 3[46,XN/46,XN,del(6)(p22.1)]为非整倍体,不适合胚胎移植。Embryo 4为正常二倍体,未携带致病突变c.6491C>A(p.Ser2164Ter),适合胚胎移植。结论:1.PKD1基因新的无义突变c.6491C>A(p.Ser2164Ter)和已知的移码突变c.1260812635del(p.Arg4203Profs*146)是本研究ADPKD家系的致病突变。2.目标序列捕获-高通量测序是一种快速、高效的ADPKD基因检测方法。3.SNP单体型分析结合Sanger测序和高通量测序是一种新的ADPKD胚胎植入前遗传学诊断策略。4.MALBAC适合进行PGD单细胞全基因组扩增。5.测序深度的增加能够提高胚胎植入前非整倍体筛查的准确性。