昆虫干细胞生物学是昆虫学研究领域的前沿热点难点之一,但截至目前除果蝇外,昆虫干细胞的研究开展尚不充分。家蚕作为鳞翅目昆虫的典型代表,其一生经历多次新旧组织的交替和结构形态的变化,开展家蚕干细胞研究,特别是研究家蚕发育、变态过程中干细胞调控的作用机制,将为阐明昆虫发育的调控机制奠定基础,也为鳞翅目害虫的防治新策略提供理论依据。相对于果蝇及哺乳动物较为完善的干细胞研究系统,家蚕干细胞研究技术体系的建立迫在眉睫。针对目前缺少家蚕干细胞特异性分子标记这一关键技术难题,选取起源于胚胎发育时期具有分化潜力的神经母细胞瘤细胞作为替代研究对象,寻找调控神经母细胞瘤细胞增殖与分化的关键酶基因,阐明靶点基因对其细胞增殖与分化的作用机理,探索该肿瘤的发生机理,借鉴其研究结果,将为开展家蚕干细胞的鉴定、维持及分化的调控研究提供理论参考。神经母细胞瘤是一种儿童最常见的颅外实体肿瘤,主要起源于交感神经系统中的神经嵴祖细胞,其临床表现具有高异质性、恶性程度高、预后差、易转移和易复发等特点。肿瘤细胞生长的表观遗传调控是当前肿瘤生物学研究的热点之一,诸多实验证据证实组蛋白甲基化对肿瘤的生长增殖有着十分重要的影响。组蛋白甲基化转移酶通过参与组蛋白甲基化,对肿瘤的生长发育起着重要的作用,研究组蛋白甲基化转移酶的功能及作用机制,有重要的理论及临床价值。基于组蛋白甲基化的调控紊乱可能在多种人类疾病发生发展中具有重要作用,本研究以组蛋白甲基化转移酶G9a及5种神经母细胞瘤细胞作为研究对象,利用神经母细胞瘤在线临床数据库中患者基因组表达数据进行分析,探讨G9a与神经母细胞瘤患者预后之间的关系。利用G9asi质粒通过慢病毒转染系统对神经母细胞瘤细胞进行转染,并同时使用G9a特异性抑制剂处理细胞,检测G9a受到抑制时对神经母细胞瘤细胞生长与增殖的影响,探讨G9a在神经母细胞瘤细胞中对组蛋白甲基化的形式的影响及其对细胞生长增殖调控作用的分子机制,为神经母细胞瘤的临床治疗新策略提供理论依据及新思路,为家蚕干细胞的维持及分化调控提供理论支持。本研究获得的主要研究结果如下：1.组蛋白甲基化转移酶G9a与神经母细胞瘤预后的关系分析利用两个独立的神经母细胞瘤临床在线数据库,检索组蛋白甲基化转移酶G9a在神经母细胞瘤患者基因组表达谱中的表达情况,分析并预测G9a的表达量与神经母细胞瘤患者预后的关系。结果表明,G9a的表达量与神经母细胞瘤患者的预后结果密切相关,G9a表达量高,患者整体存活率低,预后差；G9a表达量低,患者整体存活率高,预后好。并且,G9a在不同临床分期的神经母细胞瘤患者体内表达情况有差异,其中在IV期患者中G9a的表达量突然显著升高,而在IV-s期患者中其表达量又明显下降。在患儿诊断年龄≤18个月时,G9a的表达量低,在患儿诊断年龄>18个月时,G9a的表达量高。神经母细胞瘤的治疗效果与诊断时患儿的年龄及临床分期有关,患儿年龄越大,分期越后,肿瘤越容易扩散,则预后越差,而患儿诊断年龄18个月被定义为决定风险的关键年龄节点。基于神经母细胞瘤的这些特点,我们推测G9a可能成为神经母细胞瘤患者风险分层中的重要参考指标,并作为神经母细胞瘤预后的一个重要标记。同时我们发现G9a的表达量与神经母细胞瘤原癌基因N-MYC的扩增密切相关,由于神经母细胞瘤起源于胚胎发育过程中的神经嵴细胞,并且N-MYC的扩增与神经母细胞瘤的发生及复发紧密联系,推测G9a可能参与调控原癌基因或抑癌基因在胚胎发育过程中的表达机制,使交感神经系统发育的调控系统发生紊乱,促使神经母细胞瘤的形成。2.抑制组蛋白H3K9甲基化转移酶G9a对神经母细胞瘤细胞生长增殖的影响及机制研究为了鉴定G9a基因对神经母细胞瘤细胞生长增殖的影响及其分子机制,本研究利用G9a特异性抑制剂BIX01294(BIX)处理神经母细胞瘤细胞引起G9a抑制,并通过慢病毒转染系统利用G9asi质粒转染神经母细胞瘤细胞干涉其G9a的表达,进行细胞增殖检测和细胞周期检测。研究结果表明,G9a受BIX抑制或G9asi干涉后,神经母细胞瘤细胞的生长受到抑制,细胞数量明显减少。利用CCK8试剂盒检测细胞的增殖情况,结果显示G9a受BIX抑制或受G9asi干涉后神经母细胞瘤细胞增殖基本上被完全抑制。同时利用BrdU、Ki67等增殖标记的抗体对处于增殖周期的神经母细胞瘤细胞进行免疫荧光标记,结果发现G9a受BIX抑制或受G9asi干涉后BrdU阳性率及Ki67阳性率都显著降低,证实细胞增殖受到明显抑制。进一步利用流式细胞仪检测细胞周期,结果表明G9a受BIX抑制后G1期显著增加,S期减少,说明细胞周期阻滞在G1期。通过Western blotting检测Cyclin和CDK的表达显示,G9a受BIX抑制或受G9asi干涉后,多个G1期特异性Cyclin和CDK的蛋白水平明显降低,推测G9a可能调控G1期特异性Cyclin和CDK的表达,促使细胞周期阻滞在G1期,不能顺利进入S期,从而抑制细胞增殖。3.抑制组蛋白H3K9甲基化转移酶G9a引起神经母细胞瘤细胞自噬及其机制研究本研究发现G9a受到抑制后神经母细胞瘤细胞生长增殖受到抑制作用,为了探讨G9a受到抑制引起神经母细胞瘤生长增殖受到抑制的作用机制,本研究利用G9a特异性抑制剂BIX处理神经母细胞瘤细胞引起G9a抑制,并通过慢病毒转染系统利用G9asi质粒转染神经母细胞瘤细胞干涉其G9a的表达,利用台酚蓝对BIX处理后的神经母细胞瘤细胞进行染色发现,G9a受抑制后死亡细胞的数量增加,并且通过显微镜观察细胞核周围出现点状物质的聚集并产生空泡结构,推测G9a受到抑制导致细胞发生自噬从而抑制细胞生长增殖。微管相关蛋白LC3B能够标记自噬体的形成,本研究进一步利用LC3B抗体对细胞进行免疫荧光染色,结果显示G9a受BIX抑制或受G9asi干涉都促使LC3B大量表达,证实细胞自噬的发生通过Western blotting检测多个自噬相关基因ATG的蛋白表达,结果显示G9a受BIX抑制或受G9asi干涉促进ATG表达升高及LC3B表达增强,同时通过Western blotting检测到BIX处理后神经母细胞瘤细胞G9a蛋白表达没有明显降低,但H3K9me2水平显著下降,说明抑制剂BIX不影响G9a的表达,但显著抑制G9a的功能,并且G9asi干涉后H3K9me2也显著降低,推测G9a功能失活导致H3K9me2的水平受到抑制,促使LC3B和ATGs的转录增加,从而促进细胞自噬的发生。4.抑制组蛋白H3K9甲基化转移酶G9a对神经母细胞瘤细胞自我更新能力及致瘤性的影响研究神经母细胞瘤作为一种儿童常见的交感神经系统恶性肿瘤,因为其高异质性,极易发生转移及复发,因此其治疗十分困难。恶性肿瘤易转移、易复发是因为在肿瘤细胞中存在一小群细胞,称为肿瘤干细胞,其能够引发肿瘤的发生发展并维持肿瘤的特性,并且其具有无限复制和自我更新能力。为了进一步阐明G9a对神经母细胞瘤细胞生长发育的影响,本研究利用软琼脂克隆形成实验及神经母细胞瘤小鼠模型的建立,检测抑制G9a对神经母细胞瘤细胞自我更新能力及致瘤性的影响。将神经母细胞瘤细胞稀释成单细胞种入软琼脂进行培养,发现BIX处理后的细胞或G9asi干涉后的细胞几乎不能在软琼脂上形成克隆,而对照组细胞能够形成大量克隆,统计分析证实G9a受BIX抑制或受G9asi干涉后,细胞在软琼脂上形成的克隆数量显著减少,说明神经母细胞瘤细胞的自我更新能力受到抑制。利用免疫缺陷小鼠模型将神经母细胞瘤细胞移植到小鼠皮下形成异植瘤,给予抑制剂BIX治疗,结果发现抑制剂BIX处理后肿瘤块大小、肿瘤体积及重量显著小于对照组,但BIX对小鼠的体重没有明显影响,说明BIX作用于肿瘤细胞并抑制其致瘤性,具有重要的科学意义,为筛选抗神经母细胞瘤药物靶标奠定了理论基础。