目的:本研究旨在通过大容量噬菌体纳米抗体文库筛选出与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4）结合的纳米抗体,为其后续应用开发奠定物质基础。方法与结果:（1）通过在Uniprot蛋白数据库中查找CTLA-4胞外段（CTLA-4 ECD）序列并合成到pCMV真核表达载体上,得到pCMV-CTLA-4 ECD重组蛋白表达质粒。并用PCR扩增,酶切,连接,转化等技术,亚克隆得到pcDNA3.4-CTLA-4 ECD重组蛋白表达质粒。（2）通过少量瞬转,比较两种重组质粒的表达量,确定用pCMV-CTLA-4 ECD大量瞬转入HEK 293F细胞,通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,最终获得CTLA-4 ECD蛋白,其与CTLA-4 mAb有结合活性,且蛋白纯度大于90%。（3）首先,扩增辅助噬菌体VCSM13,辅助噬菌体滴度为5×10¹22 cfu/mL,再利用纯化得到的CTLA-4 ECD蛋白进行包板,利用大容量天然噬菌体纳米抗体文库,经过首轮扩增,3轮淘洗,最后筛选。最后,获得具有纳米抗体序列差异的3株纳米抗体,其被命名为Nb_{CTLA-4 ECD},分别记作F2、E3、G4。通过软件分析Nb_{CTLA-4 ECD}的理化特性,其分子质量在17.4-18.1 kDa范围内,理论等电点在6.27-9.3范围内,由于3株纳米抗体的GRAVY都小于0,则为亲水性蛋白。（4）少量抽提pMECS-Nb_{CTLA-4 ECD},将其电转入E.coli WK6中,通过终浓度为1mM的IPTG诱导菌种表达,然后使用高渗透压差法提取纳米抗体,蛋白质经Ni-NTA柱纯化,Nb_{CTLA-4 ECD}蛋白纯度达93%以上。3株Nb_{CTLA-4 ECD} WK6的蛋白产量在4.66-5.84 mg/L范围内,其中产量最高的是G4,达到了5.84 mg/L。（5）通过ELISA检测Nb_{CTLA-4 ECD}特异性与热稳定性。特异性实验证明,3株Nb_{CTLA-4 ECD}均与CTLA-4 ECD特异性结合能力较强,与其它6种对照抗原的结合能力较弱,G4具有最强的结合能力。热稳定性实验证明,Nb_{CTLA-4 ECD}与阳性对照CTLA-4 mAb相比在60℃处理下具有明显优势。（6）借助A375黑色素瘤细胞,研究3株纳米抗体与细胞膜上CTLA-4分子的特异性结合活性,通过流式检测显示,3株纳米抗体均能识别细胞膜表面表达的CTLA-4,且G4的结合活性最高。结论:本文成功构建了真核表达质粒,并通过发酵纯化最终获得具有结合活性且纯度大于90%的CTLA-4 ECD重组蛋白,包被得到的抗原蛋白,从噬菌体纳米抗体文库中淘洗筛选得到3株与CTLA-4 ECD结合的纳米抗体。具有分子量小,热稳定性高,特异性强等特点,且与A375细胞膜上CTLA-4蛋白有一定的结合活性。综上所述,筛选出的3株纳米抗体均有开发成为阻断CTLA-4的抑制剂潜力,为其后续应用开发奠定了物质基础。