随着肿瘤分子生物学及遗传学的快速发展,人们逐渐认识到包括肺癌在内的恶性肿瘤的发生、发展、局部侵袭和远端转移是一个多步骤、多基因参与调控的复杂生物学过程,具有协同累计效应且与患者机体的免疫功能密切相关。此外,在恶性肿瘤患者体内具有复杂而异质性的肿瘤微环境,导致只有某些进入淋巴管或血管的瘤细胞亚群得以优势生长,获得转移表型。而这些具有高转移潜能的瘤细胞如何逃避机体免疫系统的监视、抵御抗原特异性T细胞杀伤作用的机制尚未完全阐明。因此,当今研究除了需研发有效的分子检测技术对肺癌患者做出临床早期诊断外,还需对在肺癌发生、发展和免疫逃逸中发挥重要作用的信号途径及靶分子进行深入研究。近年来,通过对肿瘤免疫耐受和逃逸机制的广泛而深入的研究发现,参与机体免疫调节的协同刺激分子的表达异常在肿瘤的免疫逃逸中扮演着重要角色。近几年,CD28/B7协同刺激分子家族成员不断扩大,PD-1/PD-L1作为CD28/B7协同刺激分子超家族的新成员,可以介导负性协同刺激信号,能有效抑制T、B细胞功能和增殖,同时减少细胞因子IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌,该抑制途径参与的免疫调节在肿瘤免疫、自身免疫、病毒感染、移植免疫等疾病的研究中都具有重要意义。越来越多的研究发现,许多协同刺激分子能分别以细胞膜型和可溶性两种形式存在,包括CD40、4-1BBL、OX40L、CD86、CD80和CTLA-4等。临床研究显示,许多可溶性协同刺激分子的表达水平具有诊断或疾病预后判断的价值。患者肿瘤组织表达的PD-L1也可用于某些肿瘤临床疗效的参考指标。目前,因缺乏有效的检测方法,国内外鲜有对可溶性PD-L1(sPD-L1)的研究报道。健康人机体内是否存在sPD-L1因子,该可溶性因子在肿瘤患者尤其是肺癌患者体内表达水平是否出现异常及其生物学意义尚无深入研究,值得进一步探讨。本研究收集临床肺鳞癌患者的组织标本,通过体外克隆化培养和筛选建立了人肺鳞癌细胞系,同时,体外实验研究发现肺鳞癌细胞系高表达人PD-L1分子,且其通过PD-1/PD-L1抑制途径对T细胞生物学功能发挥负性调节作用;应用课题组自主研发的特异性检测sPD-L1的ELISA体系对临床肺癌患者开展深入研究,检测sPD-L1在肺癌患者外周血的表达水平,分析其各项临床诊断指标的相关性,揭示该因子的表达水平与肺癌发生、发展的关系,探讨sPD-L1是否可以作为肺癌患者临床诊断、疗效预测和预后判断的依据,以PD-L1为作用靶点,为肺癌的临床治疗提供一种新的免疫干预手段,在此基础上,进一步探讨sPD-L1对免疫细胞的调节机制。【目的】利用肺鳞癌组织分离并体外克隆培养建立人肺鳞癌细胞系,分析人PD-L1分子在肿瘤细胞上的表达特性并探讨PD-1/PD-L1抑制途径对人T淋巴细胞的生物学功能的影响。【方法】选取临床病理确诊为肺鳞癌的患者,取其术后的新鲜组织标本经体外研磨分离形成单细胞悬液,体外培养并进行反复筛选和多次克隆化获得能稳定生长繁殖的肿瘤细胞系;应用单克隆抗体标记和流式细胞术检测该细胞表面PD-L1分子的表达特性;采用Ficoll密度梯度离心分离法和细胞纯化试剂盒获取人外周血T细胞;应用CCK-8掺入法体外研究PD-L1对T细胞增殖和活化的抑制作用;应用ELISA方法检测Th1和Th2型细胞因子的表达水平,探讨肿瘤细胞产生免疫逃逸的机制。【结果】肺鳞癌患者的组织标本经体外分离、培养和筛选,可以获得能稳定生长繁殖的细胞系,该细胞系具有肿瘤细胞的生长形态和特征,能在体外培养环境中持续存活增殖;应用流式细胞仪检测分析该细胞表面PD-L1的表达特性,结果显示,PD-L1在人肺鳞癌细胞呈组成性高表达;体外实验发现,该细胞能够通过PD-1/PD-L1信号抑制T淋巴细胞的增殖和活化;该研究还发现表达PD-L1的肺鳞癌细胞可有效抑制T细胞产生IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ,若利用阻断型抗人PD-L1抗体阻断该负性信号则可以部分恢复T细胞分泌细胞因子的能力。【结论】人肺鳞癌细胞的建立和鉴定为该类肿瘤的研究提供了物质材料,同时,组成性高表达人PD-L1分子的细胞系的获得将为进一步体外研究PD-1/PD-L1抑制途径在人肺鳞癌细胞免疫逃逸中的生物学作用提供更多的研究结果。【目的】应用自主研制的特异性检测人sPD-L1的ELISA试剂盒定量分析临床肺癌标本sPD-L1的表达水平和特性,分析该因子的表达水平与患者临床特征、疗效及预后的相关性,探讨sPD-L1在肺癌患者外周异常表达的生物学意义。【方法】利用该sPD-L1 ELISA试剂盒检测分析该因子在正常人和肺癌患者外周血和胸水中的表达水平,将获得的结果用统计学软件与各项临床特征、疗效指标及预后指标作相关性分析;通过流式细胞术检测肺癌患者和健康人群淋巴细胞亚群变化情况,并且进一步双标检测CD4+PD-1+T细胞、CD8+PD-1+T细胞数量的变化情况,探讨sPD-L1在PD-1/PD-L1信号通路中的作用。【结果】在正常人外周血中存在sPD-L1的表达,肺癌患者外周血的sPD-L1水平明显高于正常对照组;该因子在肺癌患者血清中异常高表达和淋巴结转移、临床分期密切相关;通过对患者血清与胸水中sPD-L1含量的比较发现,恶性胸水sPD-L1平均水平明显高于血清;通过连续采样监测治疗前后不同时点外周血清中sPD-L1含量的动态变化,结果显示患者血清中sPD-L1含量的变化与临床疗效的评估结果基本一致,血清sPD-L1的表达水平与临床疗效呈显著负相关;在预后方面低表达sPD-L1组肺癌患者无进展生存期更长、1年生存率更高,预后更好。sPD-L1评估肿瘤免疫逃逸潜能的作用类似于其他血清肿瘤标志物在评价肿瘤负荷中的水平。流式细胞术检测结果表明,肺癌患者外周血T、B细胞及亚群呈现异常改变,其中CD8+T细胞数量显著减少,CD4/CD8比值显著升高,进一步双标检测发现T细胞亚群中CD4+PD-1+、CD8+PD-1+百分率均增高,其中CD8+PD-1+百分率比健康人明显增高。【结论】肺癌患者外周血清中异常高表达的sPD-L1能促进PD-1/PD-L1负性信号,使肿瘤抗原特异性PD-1+ T细胞失能,这有利于微环境中的肿瘤细胞生长和免疫逃逸,是肿瘤发生和发展的先决条件,与肿瘤进展和预后密切相关,其表达强度可能在肿瘤临床疗效和预后预测中发挥重要作用。【目的】研究sPD-L1对PD-1/PD-L1和CD28/B7.1分子的相互作用方式,揭示sPD-L1通过PD-1/PD-L1和CD28/B7.1信号通路对T细胞免疫功能的调节作用。【方法】应用免疫荧光技术分析人外周血静止性T细胞和活化T细胞表面CD28和PD-1的表达特性;利用L929/PD-1、L929/B7.1基因转染细胞和PD-L1Ig、CD28Ig蛋白等应用间接免疫荧光和流式细胞仪检测分析PD-L1Ig与PD-1、B7.1两种膜分子的结合能力,同时,应用直接ELISA法分析PD-L1Ig与PD-1、B7.1分子的相互作用;体外研究可溶性PD-L1在L929/B7.1基因转染细胞协同刺激T细胞过程中的作用。ELISA法检测肺癌肿瘤细胞培养上清中sPD-L1的产生,利用WST(CCK-8)掺入法分析该上清对T细胞增殖的影响。【结果】流式细胞仪检测结果表明,人外周血静止性T细胞组成性表达CD28分子,低表达或不表达PD-1分子,而活化T细胞表面则上调性表达PD-1分子,同时CD28分子的表达略有下调,PD-L1Ig蛋白能与L929/B7.1基因转染细胞特异性结合,直接ELISA法检测结果也显示,PD-L1Ig融合蛋白能与B7.1包被蛋白发生结合作用,但其结合能力并没有CD28/B7.1两者之间显著,可溶性PD-L1Ig蛋白能够降低B7.1信号对T细胞的促增殖作用。ELISA检测发现细胞表面表达PD-L1分子的肺癌细胞株均能产生sPD-L1因子,而细胞表面不表达PD-L1的细胞株在培养上清中没有该可溶性蛋白的产生。PD-L1+肺癌细胞培养上清对T淋巴细胞的增殖具有一定的抑制效应,将sPD-L1预去除的上清对T细胞生长的抑制性影响有一定的降低。【结论】肿瘤细胞生长过程中产生大量的sPD-L1可能参与了CD28/B7.1刺激信号的调节,通过与B7.1分子的结合进而使得组成性表达CD28分子的静止性T细胞不能有效获得B7.1的刺激信号,肿瘤抗原特异性T细胞不能及时活化并清除肿瘤细胞,导致肺癌细胞产生免疫逃逸。综上所述,本课题研究获得了以下研究结果:(1)利用临床手术切除肺癌标本体外分离和克隆化筛选培养,建立了可以传代培养的肺鳞癌细胞系,该肺鳞癌细胞系及商品化的肺鳞癌细胞株细胞膜表面均组成性高表达人PD-L1分子,在体外T细胞共培养体系中可以抑制T淋巴细胞的激活、增殖及细胞因子的分泌,通过PD-L1阻断型单抗可以部分恢复T细胞产生细胞因子的能力。提示肿瘤细胞表面的膜型PD-L1系通过和激活的T细胞膜表面的PD-1结合而产生负性免疫调控作用。(2)利用自主研发的sPD-L1 ELISA试剂盒,发现肺癌患者血清中存在sPD-L1高表达,且这种高表达和肺癌的肿瘤负荷和病变范围有关,且肿瘤局灶如恶性胸水中sPD-L1水平高于血清水平。临床随访研究发现,肺癌患者血清sPD-L1表达水平和临床疗效呈负相关,在预后方面低表达sPD-L1组肺癌患者无进展生存期更长、1年生存率更高,预后更好。(3)在sPD-L1介导负性信号的机制研究中,我们发现,人sPD-L1蛋白与B7.1蛋白具有一定的结合作用,且膜型和可溶性PD-L1因子对PD-1/PD-L1信号途径具有不同的生物学效应。sPD-L1可能通过阻断CD28/B7.1刺激信号通路抑制T细胞增殖。同时,PD-L1+肺癌细胞株体外培养过程中产生大量的sPD-L1能有效抑制T细胞活化和增殖。本课题研究表明,肿瘤患者体内中存在可溶性PD-L1,并能和膜型PD-L1一样抑制T细胞增殖和活化、发挥细胞免疫的负性调节作用。肿瘤分泌的可溶性PD-L1能同时在局部和全身水平反映肿瘤的免疫逃逸功能。通过临床研究发现sPD-L1和肺癌分期、疗效和预后转归有关,提示sPD-L1在未来肺癌的个体化治疗中可能成为重要的抗肿瘤靶点或标记分子。因此,特异性阻断PD-1/PD-L1抑制途径有望成为肿瘤靶向治疗的策略之一。