论文部分内容阅读
目的:探讨白细胞介素17A(Interleukin-17A，IL-17A)对人肝癌细胞系Hep3B、HepG2、MHCC97H及MHCC97L干性的影响，以期进一步研究IL-17A与肝癌发展之间的关系。 方法:经ELISA检测人肝癌细胞系Hep3B、HepG2、MHCC97H及MHCC97L是否能分泌IL-17A，进一步通过体外3D成球实验研究IL-17A对Hep3B、HepG2、MHCC97H及MHCC97L肝癌细胞系成球能力的影响;采用实时无标记动态细胞分析技术(Real Time Cellular Analysis，RTCA)检测IL-17A对成球能力增强的肝癌细胞增殖及迁移的影响;采用SYBR Green实时荧光定量聚合酶链式反应(QuantitativeReal-time PCR，qRT-PCR)检测加入IL-17A后成球能力增强的肝癌细胞中IL-17RA以及IL-17RC的mRNA的表达情况;运用流式细胞技术检测分析加入IL-17A后成球能力增强的肝癌细胞上干性相关表面分子标志物CD133、CD44及EpCAM的表达，同时，通过qRT-PCR检测干性相关基因SOX2，NANOG，OCT4及BMI1的mRNA的表达情况;通过蛋白印迹法(Western blot)检测上皮-间质转换(Epithelialto mesenchymal transition，EMT)相关蛋白E-钙粘蛋白（E-cadherin），N-钙粘蛋白(N-cadherin)，波形蛋白(vimentin)的表达。 结果:人肝癌细胞系Hep3B、HepG2、MHCC97H及MHCC97L自身均不能分泌IL-17A，所以可在培养上述细胞时加入IL-17A做进一步研究。研究发现，在存在50ng/ml IL-17A及接种细胞数均为500个的条件下，Hep3B细胞的成球数目显著增加[由(113.0±10.3)个增加至（180.0±7.2）个，t=5.533，P＜0.001]，而HepG2(t=0.317，P=0.760),MHCC97H(t=1.087,P=0.325)及MHCC97L(t=0.279,P=0.785)的成球数目无明显变化。同时，IL-17A促进了Hep3B细胞的增殖和迁移。对Hep3B的进一步分析发现，加入50ng/ml IL17A后，IL-17A的应答受体IL-17RA及IL-17RC的mRNA的表达水平随着作用时间的增加而升高;干性相关基因SOX2（t=4.749，P=0.042），NANOG(t=19.600,P=0.003),OCT4(t=37.310,P＜0.001),BMI1(t=16.810,P=0.004)表达显著上调;通过qRT-PCR检测mRNA水平及Western blot检测蛋白表达情况时发现，随着IL-17A作用时间的增加，EMT相关上皮源性标志物E-Cadherin的mRNA表达水平先降低后升高，蛋白表达无明显变化;间质细胞标志物N-Cadherin的mRNA及蛋白在50ng/ml IL-17A作用48小时后表达增加，vimentin的mRNA表达水平先升高后降低，蛋白不表达。 结论:IL-17A在一定程度上增强了Hep3B肝癌细胞的干性。