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随着人口逐渐老龄化,脑血管疾病成为危害人类生命与健康的常见病与多发病。其中,脑卒中成为世界上死亡和残疾的主要原因之一,缺血性脑卒中占全部脑卒中的80%以上[1]。具有高发病率、高致死率、高复发率、高致残率等特点,给社会和家庭带来了严重的经济和精神负担,且近年来趋于年轻化。目前为止,重组组织纤溶酶原激活剂（rt-PA）是唯一被证实对急性脑卒中治疗有效的药物,然而由于其有限的时间窗以及其潜在的副作用,只有少数患者得益于这种治疗[2]。脑卒中的发生是由于脑组织的血液供应缺失,引起缺血级联反应。随着氧气或葡萄糖在缺血脑组织中的耗尽,引起高能磷酸盐化合物如三磷酸腺苷（ATP）缺乏,导致组织和细胞存活所必需的能量依赖性过程（例如离子泵）的失活,最终导致脑组织细胞损伤和坏死。坏死的细胞释放一系列内容物至胞外,激活相应的炎症反应[3]。随着现代免疫学及分子生物学的快速发展,对于脑缺血再灌注病理生理机制的研究已取得重大进步。病理机制主要有氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、细胞内Ca2+的超载、自由基损伤等。在这些病理损伤机制中,炎症反应、氧化应激成为神经科学研究的热点,抗氧化应激、减轻炎症损伤、抗细胞凋亡成为治疗脑卒中的主要途径[4-7]。转录因子可调节细胞功能的多种基因,成为治疗性修复的分子靶点。然而,转录激活被视为双刃剑,因为个体转录因子可以诱导神经保护或神经毒性基因[3]。转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）是一种内源性抗氧化防御的主要调节者。在氧化应激反应中,Nrf2促进多种抗氧化基因的表达,包括酶和非酶抗氧化剂,在细胞浆内通过转位进入细胞核,结合抗氧化反应元件（ARE）,调节下游靶基因的转录。Nrf2对缺血性脑损伤起到保护作用。研究表明,Nrf2介导的许多化合物具有神经保护作用,可改善脑梗死后神经功能缺损[8]。Ho-1是Nrf2下游的重要抗氧化及解毒蛋白,是血红素降解的起始酶和限速酶,它可以促进血红素降解为CO、胆红素/胆绿素、Fe2+。HO-1及其酶解产物共同发挥着抗氧化、抗炎、抑制细胞凋亡和扩张血管、改善组织微循环等作用。研究表明,Ho-1的上调是缺血性脑损伤后保护神经元损伤的反应机制。应用药物诱导Ho-1的表达是缺血性脑卒中的一种治疗策略[9-11]。CDDO-EA是三萜类化合物2-氰基-3,12-二氧代环戊烯-1,9（11）-二烯-28-酸的乙酰胺衍生物,研究证明,CDDO-EA是血红素加氧酶-1和Nrf2/ARE信号的强效诱导剂,可通过激活Keap1-Nrf2/ARE通路发挥神经保护作用[12-14]。本实验选用雄性C57/BL小鼠为研究对象,采用改良Longa线栓法建立脑缺血再灌注模型,在此模型上观察脑缺血后Ho-1、M1/M2小胶质细胞标志物表达,以及神经功能缺失评价、脑梗死体积情况,确定缺血后炎症反应抑制情况。实验共分两部分,现将各部分进行概述。第一部分 HO-1对小鼠脑缺血再灌注脑组织的保护作用目的:观察脑缺血再灌注损伤后Ho-1的变化,研究Ho-1对脑缺血再灌注损伤所致的炎症反应的抑制作用,探讨Ho-1抑制神经炎症相关作用机制。方法:本实验选用C57/BL小鼠为研究对象,应用线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。随机将C57/BL小鼠分为4组:假手术组（sham）、对照组（vehicle）、CDDO-EA组、Sn-PPIX抑制剂组。各组取材前进行神经功能评分,TTC法测量脑梗死体积,用免疫荧光法测量小胶质细胞M1、M2型标志物表达情况,western blot监测Ho-1蛋白的表达水平。结果:1、western blot结果显示,MCAO模型组48h、72h后Ho-1表达均升高,表明缺血再灌注损伤导致Ho-1表达升高;各个给药组（25ug、50ug、100ug）的Ho-1表达均升高且差异有统计学意义。但是,给药72h后各个浓度组Ho-1升高不明显,考虑是血药浓度下降所致。2、MCAO模型组术后24h和48h神经功能缺损严重,CDDO-EA组在术后24h神经功能缺损得到改善,但无统计学差异,术后48h神经功能缺损得到明显改善,差异有统计学意义;3、TTC染色结果显示,CDDO-EA组与MCAO模型组相比,梗死体积明显减小,差异有统计学意义;4、western blot结果显示,MCAO模型组Ho-1在包浆及核中均处于高表达水平。CDDO-EA处理后,Ho-1表达明显高于模型组,差异有统计学意义。加入Sn-PIXX抑制剂后,Ho-1表达量明显减少,差异有统计学意义。5、Tunel免疫荧光染色显示,MCAO模型组梗死周边区皮层见细胞核固缩、细胞质浓缩,大量染色阳性细胞。CDDO-EA组凋亡明显改善,凋亡细胞数明显减少,差异有统计学意义。6、免疫荧光结果显示,CDDO-EA组与MCAO模型组相比,M2型小胶质细胞表达阳性率明显升高,差异有统计学意义。CDDO-EA组M1型小胶质细胞阳性率明显降低,差异有统计学意义。结论:Ho-1对缺血再灌注小鼠有较好的神经保护作用,可改善脑缺血再灌注后神经功能缺失,减小梗死面积,抑制M1型小胶质细胞表达,促进M2型小胶质细胞表达,从而减轻缺血后炎症反应,实现缺血后神经保护作用。第二部分 Ho-1通过调节小胶质细胞的极化状态参与神经保护作用的研究目的:观察LPS导致的中枢神经系统小胶质细胞炎症模型中,CDDO-EA对Ho-1上调作用,研究Ho-1对M1/M2型小胶质细胞极化状态的影响,探讨Ho-1抑制神经炎症相关机制。方法:脂多糖（LPS）诱导体外BV2激活,CDDO-EA与激活的BV2共培养,采用MTT法检测BV2细胞活性,排除LPS对细胞毒性作用,Griess试剂法测定NO含量,ELISA法检测炎性因子的表达,western blot法检测Ho-1表达,实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,Q-PCR）测定体外小胶质细胞M1期及M2期小胶质细胞标志物的表达情况,尼罗红微球实验分析CDDO-EA对体外BV2吞噬的调节作用。结果:1、MTT法检测细胞活性显示,空白对照组BV2细胞状态良好。加入LPS后,当LPS浓度低于100ng/ml时,细胞活性均高于90%,随着LPS浓度的增加,细胞活性下降,当浓度达1ug/ml时,LPS对BV2毒性作用较大,细胞活性低于55%。2、NO检测、炎性因子的表达LPS刺激BV2细胞后,炎性因子表达增加。LPS+PBS组NO含量、TNF-α、IL-6含量增高,LPS+CDDO-EA组含量较LPS+PBS组降低。与LPS+PBS组相比,LPS+CDDO-EA组IL-10含量增加明显,且有统计学差异。3、western blot检测Ho-1表达水平显示,与LPS组相比,CDDO-EA各个浓度组Ho-1表达均升高,差异有统计学意义。Sn-PPIX组与CDDO-EA组相比,Ho-1表达明显降低,差异有统计学意义。4、实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,Q-PCR）测定体外小胶质细胞M1期及M2期小胶质细胞标志物的表达情况。结果显示,CDDO-EA组M1型标志物的表达量较LPS组表达量下调。Sn-PPIX组M1型标志物表达量有所增加。CDDO-EA组M2型标志物的表达量较LPS组明显升高。Sn-PPIX组M2型标志物表达量下调,差异有统计学意义。5、尼罗红微球实验分析CDDO-EA对体外BV2吞噬的调节作用。CDDO-EA组BV2相对于LPS组吞噬微球数增多,吞噬能力增强,差异有统计学意义,Sn-PPIX组吞噬微球数较CDDO-EA组明显减少,差异有统计学意义。结果提示,Ho-1可增强BV2吞噬能力,减轻炎症反应。结论:Ho-1可调节活化小胶质细胞的极化状态,抑制M1型小胶质细胞,促进M2型小胶质细胞,从而减轻炎症反应。