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一、研究背景肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)简称肾癌,其起源于肾实质泌尿小管上皮系统,属于泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,发病率位居泌尿系统第三位,仅次于前列腺癌和膀胱癌。目前,局限性原发性肾癌的标准治疗方法还是以肾癌根治术为主,然而接近30%患者在手术切除肿瘤后会出现复发或转移。肾癌起病隐匿,大多数患者属于无症状肾癌,常在体检时发现。但是,约30%原发性肾癌患者在确诊时已经转移,已达晚期。近年来,分子靶向药物兴起,其中主要靶向肾癌发生发展中的重要分子VEGFR的药物,如舒尼替尼、索拉非尼等,能够一定程度上改善患者的预后,但是约有40-50%患者对其不敏感且存在耐药。因而,寻求新的肾癌治疗靶点是当今的研究热点。TRIM家族蛋白是进化上保守的蛋白质,它们参与多种细胞过程,包括细胞内信号转导,细胞分化,细胞凋亡,先天免疫,炎症反应以及癌变。大多数TRIM蛋白赋予泛素化E3连接酶活性并促进翻译后修饰,包括介导泛素化事件。一些研究报道表明,TRIM蛋白可作为致癌基因或肿瘤抑制因子影响几类肿瘤的发生发展。譬如,TRIM28在乳腺癌和肺癌中上调进而发挥促瘤作用。TRIM59的上调与胃癌和肺癌的预后不良有关。然而,TRIM29抑制肝细胞癌的发生与发展。现已报道发现高水平的TRIM47表达是前列腺癌的强预后因子,TRIM47过表达可促进非小细胞肺癌的发生。因此,我们认为TRIM47是一种重要的原癌基因,参与了多种恶性肿瘤的发生、发展。尽管如此,TRIM47在肾细胞癌中的表达及生物学功能尚未被报道。二、目的研究TRIM47在肾细胞癌组织中表达水平以及其促进肾细胞癌细胞恶性生物学行为的调控机制。三、方法(一)利用肾细胞癌组织样本检测TRIM47的表达水平和其临床意义分析2017年10月至2018年2月,在东方肝胆外科医院泌尿外科收集6对新鲜肾细胞癌与癌旁组织标本,并冻存在液氮中。125例配对肾细胞癌与癌旁的组织芯片收集自东方肝胆外科医院泌尿外科。分别使用蛋白质免疫印迹技术(Western Blot)以及免疫组化技术检测组织标本和组织芯片中TRIM47的蛋白表达程度。应用q-PCR技术及TCGA数据库分析在肾细胞癌中TRIM47的m RNA表达水平及患者临床预后。(二)构建过表达TRIM47,慢病毒介导敲减TRIM47以及稳定敲除TRIM47的肾细胞癌细胞株运用蛋白免疫印迹技术筛选包括A498、769-P、OS-RC-2、786-O、ACHN、Caki-1在内的6种肾癌细胞株的TRIM47表达情况,挑选769-P、A498两种高表达TRIM47的肾癌细胞作为实验细胞。通过构建过表达TRIM47质粒转染,慢病毒介导sh RNA感染以及Crispr/cas9敲除技术构建干预TRIM47的肾癌细胞株。(三)检测过表达TRIM47和敲减TRIM47的肾细胞癌细胞株的细胞增殖以及细胞侵袭的恶性肿瘤生物学特征对过表达TRIM47质粒转染后的以及慢病毒介导sh RNA敲减TRIM47的肾癌细胞株(769-P、A498),使用CCK-8细胞增殖实验以及Transwell细胞侵袭实验检测TRIM47在肾细胞癌中的肿瘤生物学特征。(四)构建动物荷瘤模型,对比TRIM47敲除肾癌细胞株与野生型细胞株在裸鼠体内成瘤效果在稳定敲除TRIM47的769-P肾癌细胞株(KO-TRIM47-769P)基础上,使用裸鼠荷瘤模型对比野生型(WT-769P)及敲除TRIM47(KO-TRIM47-769P)的769-P细胞株的成瘤情况。(五)蛋白质谱检测探究TRIM47引起肾细胞癌细胞恶性生物学行为的分子机制对野生型(WT-769P)及敲除TRIM47(KO-TRIM47-769P)的769-P细胞株进行蛋白质谱检测,分析结果。(六)免疫共沉淀实验检测769-P肾癌细胞株中TRIM47与P53的蛋白互作关系使用免疫共沉淀技术检测肾癌细胞株769-P中TRIM47于P53的蛋白互作关系,以及研究泛素化的影响。四、结果(一)在肾细胞癌组织中,TRIM47的蛋白表达水平上调使用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)对新鲜肾细胞癌与配对癌旁组织检测的结果指出,肾细胞癌组织中TRIM47蛋白表达水平相对癌旁组织显著升高。125例配对肾细胞癌与癌旁的组织芯片经过免疫组化染色后的结果提示,肾细胞癌组织标本相对于癌旁组织的TRIM47抗体染色程度明显加深,阳性细胞数量更高,数据统计结果具有显著的差异,P-value<0.001。(二)肾细胞癌患者TRIM47的m RNA表达水平q-PCR技术检测新鲜肾癌与配对癌旁组织的结果指出,肾细胞癌组织较癌旁组织TRIM47的m RNA表达水平更高,数据统计结果具有显著的差异,P-value<0.01。(三)TCGA数据库分析肾细胞癌患者TRIM47的m RNA表达水平与临床预后的关系TCGA数据库分析结果显示,TRIM47高表达的肾细胞癌患者相对于TRIM47低表达的肾细胞癌患者,总生存期(OS)缩短,预后较差。n(high)=n(low)=258,P-value=0.024<0.05。(四)TRIM47的干预显著影响肾细胞癌的细胞增殖及细胞侵袭能力过表达TRIM47后,肾细胞癌的细胞增殖能力与细胞侵袭能力显著增强,相反,敲减TRIM47后,肾细胞癌的细胞增殖能力与细胞侵袭能力显著减弱。数据统计结果具有显著的差异,P-value<0.01。(五)TRIM47敲除后抑制了肾癌细胞在裸鼠体内的成瘤效果经过3周的小鼠荷瘤实验显示,敲除TRIM47组(KO-TRIM47-769P)相比于对照组(野生型,WT-769P),小鼠体内肿瘤增殖能力减弱。(六)蛋白质谱检测分析敲除TRIM47后抑制肾癌细胞恶性生物学行为的分子机制经蛋白质谱技术分析敲除TRIM47组(KO-TRIM47-769P)及野生型组(WT-769P)的差异蛋白,根据数据分析挑选重要的抑癌蛋白(BAP1、P21、P53)及促癌蛋白(SRC、MET、c-Myc)。利用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测过表达TRIM47及敲除TRIM47后这些抑癌蛋白和促癌蛋白的变化。结果显示,过表达TRIM47后抑癌蛋白表达水平下调,促癌蛋白表达水平上调。相反,敲除TRIM47后,抑癌蛋白表达水平升高,促癌蛋白表达水平降低。(七)免疫共沉淀结果提示在肾癌中TRIM47与P53发生蛋白互作免疫共沉淀实验技术检测于肾癌769-P细胞系中TRIM47和P53发生蛋白互作,同时高表达TRIM47可以促进P53泛素化增强,提示在肾细胞癌中TRIM47可介导P53的泛素化及降解。五、结论1、TRIM47在肾细胞癌组织中表达显著上调,且与患者临床预后相关。2、TRIM47能够泛素化降解P53抑癌蛋白,进而促进肾细胞癌的发生、发展。3、TRIM47可以作为一个潜在的肾细胞癌的促癌分子,能够用于指导肾细胞癌的预后。