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背景和目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是一种慢性肾脏疾病,最终可发展成为终末期肾脏疾病(end-stage renal disease, ESRD)引发肾脏功能衰竭。在疾病的早期阶段DN患者便可以出现微量蛋白尿的临床症状,这与病程早期肾小球滤过屏障受损密切相关。肾小囊脏层上皮细胞,即足细胞结构的变化是DN的早期病理特征。足细胞是胰岛素直接作用的靶细胞,正常的足细胞胰岛素信号通路对于肾小球功能和葡萄糖摄取的维持至关重要。自噬即“自我吞噬”,是一种进化上高度保守的胞内代谢过程,通过对胞内聚集的蛋白和受损的细胞器进行降解和循环再利用参与维持细胞的稳态。研究表明,自噬缺陷可能涉及胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)和糖尿病的发病机理。目前在肝脏、骨骼肌和脂肪组织中均有自噬流影响胰岛素信号通路的报道。但是自噬对不同组织细胞胰岛素信号通路的影响各有利弊。在骨骼肌细胞中Atg5基因沉默或者药物抑制细胞自噬的同时可以其降低胰岛素敏感性。Atg5过表达的小鼠自噬活性增强,出现抗衰老的表型,包括体型偏瘦,胰岛素敏感性增强及运动功能的改善。而HCV感染诱发的自噬可能有促进IR的发生。在脂肪细胞中自噬缺陷诱导的内质网应激与胰岛素信号抵抗密切相关。然而在糖尿病环境下自噬在足细胞功能及胰岛素应答方面的作用仍不清楚。本研究中,我们旨在探讨高糖诱导的IR和人足细胞损伤及细胞自噬在该过程中的可能作用。方法1.人足细胞培养及处理：条件永生化人足细胞HPC在33℃的培养箱中(5%C02),培养基中添加10%的胎牛血清。培养基为：低糖培养基(5.5 mmol/L葡萄糖,LG)、高糖(30 mmol/L葡萄糖,HG)、高渗(30 mmol/L甘露醇,HO)。2.人足细胞葡萄糖摄取能力的评价采用2-NBDG摄取试验,利用荧光强度的不同来检测各组差异。CCK-8法检测细胞存活率。Western blot分析和免疫荧光染色检测不同处理下胰岛素受体p亚单位的磷酸化水。3.用免疫组化染色方法检测非糖尿病患者和糖尿病肾病患者肾脏组织切片中胰岛素受体磷酸化水平。4.通过、Western blot和实时荧光定量PCR检测nephrin及自噬相关标志物如LC3B、 Beclin-1和p62/SQSTM1的表达水平。5.用自噬抑制剂3-MA (5 mM)和自噬激活剂Rapa (100 nM)调节自噬活性。改变自噬活性后用2-NBDG检测葡萄糖摄取情况,用Western blot和免疫荧光检测胰岛素受体磷酸化水平,同时用Western blot检测nephrin的表达情况。结果1.高糖环境下足细胞糖摄取减少,胰岛素受体磷酸化水平降低。通过2-NBDG摄取试验发现,与LG对照组及HO对照相比,HG (30 mM)刺激72 h后HPC细胞糖摄取能力降低(P<0.05)。通过Western blot试验发现HG刺激72 h胰岛素受体磷酸化水平降低(P<0.05)。免疫荧光染色也表明HG刺激72 h后,磷酸化的胰岛素受体(Phosphoryted insulin receptor, p-IR)水平明显低于LG和HO对照组。此外,免疫组化实验还发现,糖尿病肾病患者的肾脏切片中,在肾脏肾小囊脏层上皮细胞中IR的磷酸化水平明显低于非DN患者。2.高糖环境下足细胞裂孔膜蛋白nephrin表达减少经RT-qPCR研究发现：HPC细胞在HG刺激后72 h后,足细胞裂孔膜蛋白nephrin在mRNA水平表达显著降低(P<0.05)。通过、Vestern blot实验进一步验证了该结论：HG组与LG组及HO组相比,nephrin的蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。3.高糖环境下自噬的改变Western blot检测结果显示,高糖(HG 30mmol/L葡萄糖)与低糖(LG 5.5 mmol/L葡萄糖)及高糖与高渗组(HO 30mmol/L甘露糖)相比,刺激72h后,HPC细胞的LC3B II水平均降低,Beclin-1与对照组比较水平也明显降低,p62水平升高(P<0.05). RT-qPCR结果表明,高糖刺激72 h下的HPC细胞LC3B的mRNA水平明显降低(P<0.05),p62/SQSTM1的mRNA水平明显升高(P<0.05),而beclin-1的mRNA水平在HG刺激72 h下与LG及HO组相比均无显著改变(P>0.05)。4.足细胞自噬对其胰岛素敏感性的调节Western blot结果表明,自噬抑制剂3-MA可以明显降低自噬水平,具体表现为LC3BII的降低及P62蛋白的累积(P<0.05),而Rapa可以增加LC3BⅡ及Beclin-1的表达(P<0.01)并减少P62蛋白累积(P<0.05)。3-MA和Rapa对自噬活性的调节作用也在免疫荧光结果中得到了验证。此外结果表明,3-MA在降低自噬活性的同时可以降低葡萄糖的摄取水平(P<0.01),减少IP的磷酸化。Rapa在激活自噬的同时增加2-NBDG摄取(P<0.05),提高IR的磷酸化水平。免疫荧光试验的结果进一步支持了这一结论。最后,我们发现3-MA在降低自噬活性的同时可以减少nephrin表达水平(P<0.01),加剧高糖对足细胞裂孔膜蛋白nephrin的损伤,而Rapa则使nephrin表达水平增加,可以减轻高糖环境对足细胞的这种损伤(P<0.01)。结论1.高糖暴露导致足细胞损伤,胰岛素反应受损。2.高糖下足细胞自噬活性下降。3.抑制自噬水平可以加剧高糖诱导的胰岛素抵抗,进而加重足细胞损害。4.激活自噬可以一定程度上恢复胰岛素敏感性,减轻高糖诱导的足细胞损伤。