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背景:我国作为慢性肝炎及肝硬化大国,原发性肝癌发病率居世界首位,每年发病率及病死率均占全球一半以上。目前原发性肝癌是我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因。手术是肝癌最主要、最有效的治疗方法,其次有肝动脉化疗栓塞术(Transarterial chemoembolization,TACE)、局部射频消融、放疗、系统治疗(化疗及靶向治疗)、中医药治疗、免疫治疗等。但由于原发性肝癌具有隐匿性及高侵袭性的特点,大部分患者在发现时已是中晚期,失去了接受手术治疗的机会。有效的系统治疗可以减轻肿瘤负荷,改善症状,延长生存。常用的一线系统治疗为靶向治疗,首选索拉菲尼(证据等级1)。临床常首选一种系统治疗方式,耐药或进展后更换为另一种系统治疗方式,如首选靶向治疗,可更换为包含奥沙利铂(Oxaliplatin)的FOLFOX化疗,但是Oxaliplatin在肝癌患者中应用时易产生原发性及继发性耐药。有研究发现,通过Saracatinib与细胞毒药物或其他抗癌药物联合使用可改善肝细胞癌预后。因此本研究尝试探索Saracatinib与Oxaliplatin联合或序贯应用对肝癌细胞的作用及其相应机制。目的:1、明确Saracatinib联合及序贯Oxaliplatin在肝癌治疗中的效果;2、探索Saracatinib和Oxaliplatin治疗肝癌的最佳组合方式;3、研究Saracatinib联合或序贯Oxaliplatin治疗肝癌以及化疗耐药机制。方法:1、选择人肝癌细胞株MHCC97L细胞株作为实验细胞,通过CCK8检测细胞增殖初步验证Saracatinib及其他分子靶向药联合Oxaliplatin作用于MHCC97L细胞株的疗效,并通过CCK8检测细胞增殖活性,绘制细胞增殖曲线图形式再次验证联合的疗效;2、设计Saracatinib与Oxaliplatin互相序贯化疗方案,体外构建Saracatinib耐药的肝癌细胞株MHCC97L-Src,Oxaliplatin耐药的肝癌细胞株MHCC97LOxa,通过CCK8测细胞增殖比较IC50值说明MHCC97L-Src耐药细胞株对Oxaliplatin的耐药性改变,MHCC97L-Oxa耐药细胞株对Saracatinib的耐药性改变;3、对耐药相关基因进行确定:通过前期比较分析野生型MHCC97L细胞株及MHCC97L-Src细胞株基因表达谱,野生型MHCC97L细胞株及MHCC97LOxa细胞株基因表达谱,找到共同表达的基因,并通过KEGG通路分析两种细胞系中共同改变的基因,再把我们需要验证的差异性基因进行基因相对表达量的检测,在两耐药细胞株中表达倍数均最高的基因作为耐药相关基因进行后续试验。4、Western Blot验证MHCC97L细胞株及MHCC97L-Src细胞株中此耐药蛋白的表达,通过小干扰RNA沉默MHCC97L细胞株及MHCC97L-Src细胞株中耐药蛋白的表达后,再次通过CCK8检测其对Oxaliplatin敏感性的改变。5、采用SPSS 25.0软件、Graphad prism 7.0软件进行数据分析,两组间计量数据比较采用双侧Student’S t检验法,以评价平均值差异的统计学显著性。实验至少进行3次,p<0.05为差异有统计学意义。结果:1、本研究首先初步筛选了Oxaliplatin与抗癌分子靶向药物(包括PI3K、MAPK通路等中29种抑制剂,包括Src抑制剂Saracatinib)联合用药的疗效,发现Oxaliplatin与Saracatinib联合使用产生了拮抗作用;2、MHCC97L-Src耐药细胞株对Oxaliplatin的化疗敏感性明显减弱(108.71±11.24μmol/L vs.20.85±4.86μmol/L;p=0.0092);MHCC97L-Oxa细胞株对Saracatinib的化疗敏感性明显增强(1.23±0.31μmol/L vs.4.30±0.97μmol/L;p=0.0141),两组间差异均有统计学意义(p<0.05);3、选择ABCG1基因作为耐药基因进行后续实验;4、通过Western Blot验证了MHCC97L细胞株及MHCC97L-Src细胞株均表达ABCG1蛋白,且MHCC97L-Src细胞株对细胞膜外排蛋白ABCG1蛋白表达显著上调。应用si-RNA技术,沉默MHCC97L细胞株及MHCC97L-Src细胞株ABCG1基因,发现两种细胞株对Oxaliplatin化疗耐药性均降低(25.59±5.82μmol/L vs.8.41±2.09μmol/L;p=0.0085)及(40.43±8.12μmol/L vs.103.71±8.74μmol/L;p=0.0008),两组间差异均有统计学意义(p<0.05)。而且Oxaliplatin联合Saracatinib处理沉默ABCG1基因的MHCC97L细胞株(MHCC97LsiABCG-AZD0530(2μM)),未产生显著拮抗作用(9.73±1.26μmol/L vs.11.84±2.11μmol/L;p=0.2090),两组间差异无统计学意义(p>0.05)。结论:1、Oxaliplatin联合Saracatinib在人肝癌MHCC97L细胞株中产生了显著的拮抗作用;Saracatinib序贯Oxaliplatin产生了拮抗作用;Oxaliplatin序贯Saracatinib产生了协同作用;2、在MHCC97L细胞株中Saracatinib的治疗可能诱导了Oxaliplatin的耐药;3、干扰ABCG1的表达可逆转Saracatinib诱导的Oxaliplatin的耐药;4、ABCG1蛋白可能是耐药的主要机制。从而能指导:1、临床选择肝癌化疗方案时应避免Saracatinib后序Oxaliplatin的化疗方案;2、同时找到ABCG1耐药蛋白,为耐药肝癌细胞生物治疗提供了新的靶点和理论依据。