论文部分内容阅读
猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis,SS)是世界范围内存在的一种重要的人畜共患病原体。它可分为33个血清型(1/2,1-31,33),目前针对血清2型(Streptococcussuis 2,S.suis2,SS2)的研究最为深入。无论是在中国国内、东南亚地区还是世界范围内,关于SS2的研究报道最多,因为其致病性最强,感染案例最多。它可以引起猪的严重疾病,例如败血症,脑膜炎,关节炎和肺炎等,造成养猪业的巨大经济损失。在导致人类的疾病当中,脑膜炎是其最常见的表现型,此外它还可以引发其他全身并发症如败血症,肺炎等。在我国曾经爆发过两次严重的猪链球菌感染人事件,并造成重大的人员伤亡。正是在这两次爆发中,第一次观察到由猪链球菌引起的中毒性休克综合症(streptococcal toxic shock syndrome,STSS)。同时,猪链球菌病在这两次爆发中也体现出了深部组织感染和高侵袭率的临床特征。与病毒不同,细菌基因组较大,基因组结构较为复杂且构成菌体的蛋身数量很多,所以为其致病机理的研究带来了很多困难。虽然目前关于引起和促进其发病的毒力因子的研究较多,但对于猪链球菌的致病机理仍旧没有完全明确。所以,研究探索其致病菌株的毒力因子仍是当今猪链球菌的研究热点。本研究同样是围绕着探寻和验证猪链球菌的毒力因子而展开的。主要包括以下几个方面:1、猪链球菌2型强毒株特有基因mmuM的鉴定在之前的研究中通过内标化的斑马鱼模型对若干猪链球菌强弱毒株进行筛选。选取筛选到的7株弱毒株进行全基因组测序,并与NCBI上已经公布的10株强毒株全基因组进行泛基因组(pan-genome)分析。通过pan-genome分析,发现了 53个在SS2强毒株中存在但是弱毒株中没有的基因,推测这些SS2强毒株共同特有的基因是潜在的毒力因子。mmuM基因就是这53个基因之一,编码同半胱氨酸甲基转移酶(homocystine methyltransferase,HMT)。对之前用斑马鱼模型筛选到的一些猪链球菌2型强弱毒株以及猪链球菌其他血清型菌株进行PCR检测,发现mmuM基因只存在于猪链球菌2型强毒株中。因此,我们推测mmuM基因与猪链球菌2型的致病性相关,是可能的毒力因子。2、mmuM、OppA和IMPDH的原核表达及重组蛋白对HEp-2细胞的黏附性分析对猪链球菌2型强毒株特有基因mmuM进行了原核表达,同时对我们用2D far-western blot方法筛选出的15个层粘蛋白(laminin,LN)结合蛋白和5个纤粘蛋白(fibronectin,FN)结合蛋白中的两个蛋白 OppA(Oligopeptide-binding protein OppA precursor,对LN和FN均有结合性,LN结合性为第一次发现)和IMPDH(Inosine5’-monophosphate dehydrogenase,有 LN 结合性,第一次发现有此特性)进行了原核表达,并对它们的ECM结合性进行了验证。间接免疫荧光试验结果表明,以上三种原核表达得到的重组蛋白均对人喉癌上皮细胞(HEp-2)有粘附性。这一结果也证明了用2D far-western blot筛选ECM结合蛋白从而确定潜在粘附因子这一思路和方法的可行性。3、mmuM基因缺失株和互补株的构建及它们的特性分析为了验证mmuM是潜在毒力因子的推测,我们以猪链球菌2型强毒株ZY05719为研究对象,采用经典的同源重组方法,利用温敏自杀性质粒pSET4s成功构建了mmuM基因的缺失株△mmuM,然后利用穿梭质粒pSET2成功构建了互补株C△mmuM。基本的生物学特性研究发现ZY05719、AmmuM和CAmmuM三者的生长特性、溶血特性、革兰氏染色特性及电镜下的菌体形态相近。通过对本室保存的其他血清型的猪链球菌进行PCR检测,发现其他血清型中.并不含有mmuM基因,这就进一步提示mmuM基因只存在于猪链球菌2型强毒株中;通过斑马鱼毒力试验发现,相对于野生株ZY05719,缺失株的毒力水平有所下降;细胞粘附试验发现,△mmuM缺失株对人喉癌上皮细胞(HEp-2)的粘附能力显著下降;全血存活试验(Whole blood survival assay)表明缺失株在猪抗凝全血中的存活率相对于野生株有较为明显的下降;实时荧光定量PCR显示已报道的公认毒力因子sly2C、mrp和sly在缺失株AmmuM中的转录水平均有所下降。我们推测,mmuM基因可能也是猪链球菌2型的一个毒力因子。4、△mmuM和ZY05719的差异蛋白质组学分析Label-free蛋白质组学对野生株ZY05719、缺失株△mmuM全菌蛋白表达水平进行分析。发现了 91个在缺失株中比在野生株中表达水平下调1.5倍的蛋白,66个在缺失株中表达水平比在野生株中表达水平上调1.5倍的蛋白,而且这些蛋白的表达水平差异显著(P<0.05)。在缺失株中表达下调的蛋白中,发现几个下调明显的且已报道与细菌对细胞的粘附性或者毒力相关的蛋白,包括3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase,6-PGD)、5-单磷酸次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(inosine-5-monophosphate dehydrogenase,IMPDH)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)等等。