【摘 要】
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人体是由种类繁多的功能不同的细胞组成,不同的细胞具有相同的基因组和各不相同的染色质构象,表现为不同的基因表达模式和细胞功能。研究细胞内染色质的空间分布及相互作用,对了解细胞功能、基因表达,揭示生命现象的规律和本质有着十分重要的意义。反映染色质构象性质的特征尺度都在纳米量级,远远超出了光学显微镜的分辨极限。近年来,远场超分辨荧光显微技术的发展突破了这一限制,达到了横向（x,y）10-20nm,纵向（
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人体是由种类繁多的功能不同的细胞组成,不同的细胞具有相同的基因组和各不相同的染色质构象,表现为不同的基因表达模式和细胞功能。研究细胞内染色质的空间分布及相互作用,对了解细胞功能、基因表达,揭示生命现象的规律和本质有着十分重要的意义。反映染色质构象性质的特征尺度都在纳米量级,远远超出了光学显微镜的分辨极限。近年来,远场超分辨荧光显微技术的发展突破了这一限制,达到了横向（x,y）10-20nm,纵向（z）20-50 nm的空间分辨率,为人们在单分子水平上观察、研究染色质构象提供了强有力的研究工具。目前,研究人员利用超分辨荧光显微镜已经获得了4.9 kb DNA的二维纳米分辨图像,但对更短的核内非重复基因组序列（如1-2 kb的启动子,增强子）的特异性标记和高分辨率成像依然面临诸多挑战,例如结合效率低,非特异结合背景高等问题。针对上述问题,为了实现在纳米尺度上原位观察非重复的短基因片段,本论文提出了一种能够对特异性非重复DNA序列进行荧光原位标记的方法,结合自主搭建的三维超分辨荧光显微系统,分别实现了对外源和内源2.5 kb DNA片段的三维纳米成像,为探索染色质精细的三维折叠结构,以及揭示染色质如何参与基因调控提供了研究手段上的支持。本论文的主要工作如下:1.在随机光学重建显微（stochastic optical reconstruction microscopy,STORM）成像基础上,开展了基于柱面镜像散原理的3D-STORM超分辨显微成像方法研究,分析了荧光分子开关特性的闪烁机制,理论分析了柱面镜成像原理,对比了不同定位算法之间的差异。理论计算了入射角度和激发层厚度之间的关系,利用斜照明抑制非焦面荧光背景。搭建了三维超分辨成像系统,利用横向漂移校正算法和轴向实时负反馈方法结合的方式,建立了高精度的三维纳米分辨防漂移系统,实现对神经瘤母细胞微管蛋白的三维纳米成像,从纳米尺度对比了不同细胞的脂筏结构的差异。2.基于荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridization,FISH）,提出了一种利用分子信标（molecular beacon,MB）探针标记DNA序列的方法（MB-FISH）,将分子信标探针应用于基因组中非重复的短DNA片段的原位标记中。利用分子信标特殊结构所决定的热力学特性,突破了普通探针（如寡核苷酸探针）无法做到的低温杂交的限制,在低温条件下稳定地与目标序列结合,同时最大程度地降低本底信号,有效提高基因组位点被标记的效率。发展出完善的分子信标探针设计原则,通过设计针对目标序列上不同位点片段的探针,可以保持目标序列在基因组中的特异（唯一）性。通过不断地优化杂交实验条件,最终实现对非重复序列DNA的特异性标记。3.根据光子数分布的统计规律,建立了一种合理化分类的荧光信号识别算法,合理化区分荧光信号来源是否属于目标荧光分子。调整稀疏标记样品的成像条件,结合单分子信号识别算法,优化出最低错误发现率的超分辨成像条件,降低假阳性荧光信号干扰,有效地提高了荧光单分子的定位次数,为识别特异性纳米结构奠定了基础,同时为获得高质量纳米图像提供了保障。4.利用自主搭建的三维超分辨荧光显微系统,实现了对MB-FISH标记的2.5 kb慢病毒侵入的外源DNA以及小鼠胚胎干细胞上Nanog基因上超级增强子的三维纳米成像,获得了最短基因组序列的三维纳米结构。本论文的主要创新点如下:1.提出MB-FISH的方法,发展出完善的分子信标探针设计原则并优化探针杂交实验条件。2.根据统计模型建立了新型的单分子信号识别方法,优化出适合稀疏标记情况下的超分辨成像条件。3.利用MB-FISH分别对人类基因组中外源插入的2.5 kb非重复DNA序列和小鼠胚胎干细胞中的2.5 kb超级增强子进行标记,结合3D-STORM系统进行三维超分辨成像,首次获得至今为止最短基因组序列的三维纳米图像。
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