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研究目的CTNNB1基因（编码β-Catenin）突变是肝细胞癌（HCC）最常见的体细胞遗传事件之一,当β-Catenin被激活后,便可促进与T细胞因子（TCF）家族成员相关的基因表达,其中T-box转录因子3（TBX3）是Wnt/β-Catenin级联反应的靶基因。多项研究表明,带有CTNNB1突变的HCC肿瘤分化好,血清AFP（Alpha-fetoprotein）水平低,微血管浸润少,预后也较好,但机制尚不清楚。在本研究中,探讨了 TBX3对CTNNB1突变HCC的调控作用及相关通路,以期为HCC的发病机制和临床用药提供新的治疗靶点依据。研究方法1.数据库分析利用TCGA-LIHC人类HCC数据库,分析TBX3 mRNA的表达水平及与CTNNB1突变和其他常见基因突变之间的相关性;将HCC分为CTNNB1突变组和非CTNNB1突变组,分析TBX3在人HCC中的表达模式;分析人HCC中与TBX3 mRNA表达水平正相关和负相关的基因,并进行KEGG通路富集分析。2.体外实验通过Western blot分析9个人类HCC细胞系和1个肝母细胞瘤（hepatoblastoma,HB）细胞系中TBX3蛋白表达水平。在TBX3低表达的细胞系中转染TBX3,通过细胞克隆形成实验检测过表达TBX3产生的作用。3.体内实验3.1采用TBX3 flox/flox小鼠,通过水动力法尾静脉注射技术将c-Met、持续激活型β-catenin（ΔN90-β-Catenin）、Cre重组酶以及SB转座酶质粒共转染至小鼠体内,诱导小鼠形成原位肝细胞肝癌,且肿瘤内敲除TBX3基因。当小鼠出现巨大的腹部肿块并濒临死亡时,对其实施安乐死。取小鼠肝脏肿瘤进行石蜡包埋、切片,采用H&E染色观察组织病理学特征;采用免疫组织化学技术检测Ki67、SOX9、E-Cadherin、HNF4α和Vimentin的表达情况;采用Western blot检测ERK、AKT和STAT3通路蛋白、p-YAPSer127、p-YAPSer397、Lats2、YAP/TAZ、核YAP/TAZ和Hippo通路其他成员包括MST1/2、SAV1、MOB1和p-MOB1的表达水平;采用RT-qPCR检测肝细胞癌标志物AFP和Epcam、代谢途径相关基因的mRNA表达情况,以及YAP/TAZ下游靶基因Ctgf、Cyr61及Notch通路靶基因的mRNA表达情况。3.2采用TBX3 flox/flox小鼠,通过水动力法尾静脉注射技术将c-Met、持续激活型β-catenin（△N90-β-Catenin）、Cre重组酶、SB转座酶质粒以及Lats2质粒共转染至小鼠体内,诱导小鼠形成原位肝细胞肝癌,且肿瘤内敲除TBX3基因同时过表达YAP/TAZ的负调节基因Lats2。当小鼠出现巨大的腹部肿块并濒临死亡时,对其实施安乐死。取小鼠肝脏肿瘤进行石蜡包埋、切片,采用H&E染色观察组织病理学特征;采用免疫组织化学技术检测Ki67、SOX9、E-Cadherin、HNF4α和Vimentin的表达情况;采用 Western blot 检测 p-YAPSer127、p-YAPSer397、Lats2、YAP/TAZ、核 YAP/TAZ、Notch2和SOX9的表达水平;采用RT-qPCR检测Lats2、Ctgf和Cyr61的mRNA表达情况。研究结果1.TBX3在人类HCC中的表达模式1.1 HCC中TBX3的整体表达水平明显低于周围正常肝脏组织;TBX3高表达的HCC主要表现为CTNNB1突变。1.2 TBX3在CTNNB1突变的HCC中高表达,而在非CTNNB1突变的肿瘤中表达下调。1.3与TBX3表达呈正相关的基因主要在代谢途径中高度富集,与TBX3表达呈负相关的基因主要在癌症通路中高度富集。2.TBX3在CTNNB1突变HCC中的作用2.1 TBX3蛋白在有CTNNB1突变的HB细胞株HepG2中显示出最高的表达水平,而在其他9株HCC细胞系中低水平表达。2.2细胞克隆形成实验显示过表达TBX3显著抑制了体外HCC细胞的生长。2.3 c-Met/β-Catenin/Cre（实验组,在肿瘤中敲除了 TBX3 基因）的 TBX3flox/flox小鼠相比于c-Met/β-Catenin/pCMV（对照组）的TBX3flox/flox小鼠,肿瘤生长速度快、小鼠存活时间短、小鼠肝脏重量和肝/体重比增加。2.4 在 c-Met/β-Catenin/Cre（实验组）的 TBX3flox/flox 小鼠肝脏组织中 Ki67 和 SOX9表达增强;AFP和Epcam的mRNA表达显著上调,而代谢通路相关基因Cyp1a1、Cyp1a2和Cyp2e1的mRNA表达显著下调;核蛋白YAP/TAZ水平上调,YAP/TAZ下游靶基因Ctgf、Cyr61及Notch通路靶基因的mRNA表达显著上调。3.TBX3在CTNNB1突变HCC中对YAP/TAZ的调节作用3.1 c-Met/β-Catenin/Cre/Lats2（实验组,在肿瘤中敲除了 TBX3基因同时过表达YAP/TAZ 的负调节基因 Lats2）的TBX3flox/flox小鼠相比于 c-Met/β-Catenin/Cre/pT3（对照组）的TBX3floox/flox小鼠,肿瘤生长速度慢、小鼠存活时间长。3.2 c-Met/β-Catenin/Cre/Lats2（实验组）的TBX3flox/flox小鼠和c-Met/β-Catenin/pCMV（第二部分中的对照组）的TBX3flox/flox小鼠存活时间相似;H&E染色显示两组小鼠肝脏在组织学上形态相似。3.3 在 c-Met/β-Catenin/Cre/Lats2（实验组）的 TBX3flox/flox小鼠肝脏中,Ki67 和SOX9表达下调;总YAP/TAZ和核YAP/TAZ蛋白的表达下调;Ctgf和Cyr61的mRNA表达下调。结论1.在人的HCC中,TBX3具有双峰表达模式,在CTNNB1突变型HCC中高表达,而非CTNNB1突变型HCC中低表达。2.在体外和体内的HCC发生过程中,TBX3可能作为肿瘤抑制因子发挥作用。3.在c-Met/β-Catenin诱导的小鼠HCC中,TBX3可能通过调节YAP/TAZ的活性发挥抑癌功能（图1）。