研究背景、目的和意义贲门癌(Gastric cardia adenocarcinoma, GCA)是消化内科常见的恶性肿瘤之一,定义为发生在食管胃交界线下约2cm范围内的腺癌,又称为食管-胃交界腺癌。我国流行病学资料研究显示,贲门癌和食管癌发病具有相似的地域分布特征,世界上食管癌(EC)和贲门癌(GCA)发病率和死亡率最高的地区位于河南省林州市及其毗邻地区,其已成为肿瘤流行病学研究中最具有地域特点的案例。在林州地区及其毗邻地区已经进行了大量的关于食道癌的临床和基础研究。历史上我国曾将贲门癌归入食管癌统计,在上世纪80年代以后,按病理分类又将其归入到胃癌中,但是贲门癌逐渐作为一个具有相对独立病因、病理和临床表现的肿瘤,被作为一个独立的肿瘤用于临床和研究。近30年来,贲门癌的发病率呈明显上升趋势,相比而言胃远部肿瘤的发病率呈明显下降趋势。癌症的发病是多种因素参与,涉及多次病变的过程,贲门癌也不例外。目前研究显示贲门癌的发生主要与环境因素和遗传因素有关。癌症的分子生物学研究目前已经取得了长足的进步,癌基因和抑癌基因的发现成为攻克癌症道路上重要的成果,研究发现各种因素导致癌基因、抑癌基因和细胞凋亡基因的表达改变,破坏了贲门癌黏膜上皮细胞增殖和凋亡的动态平衡,导致了责门癌的发生。早期发现肿瘤是治疗肿瘤、提高肿瘤手术后生存率的最重要因素之一,早期贲门癌患者术后5年生存率可达90%,相比之下患者预后中期和晚期较差。所以,贲门癌患者预后的决定因素就是早期诊断,但是诊断早期贲门癌的生物学指标有利于较早发现肿瘤并且进行早期治疗,其也成为贲门癌研究的方向和热点之一。人们期望探索和建立一种敏感性高、特异性强的贲门癌早期诊断指标以及贲门癌预后预测指标,并利用这些指标作为指导治疗和判断预后的依据。蛋白质组学的方法具有高通量,灵敏度高等特点,为临床上认识和诊断各种疾病提供了有力的手段。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是近年发展起来的一种高通量的蛋白组学研究方法,已经有许多研究应用MALDI-TOF-MS的方法对各种肿瘤进行诊断和预后判断。关于贲门癌(GCA)的蛋白组学研究报道较少。本研究回顾性调查林州及其周边地区贲门癌的流行病学资料；并在此基础上,进一步应用一种新的蛋白质组学技术——由功能磁珠、ANCHORCHIP技术、MALDI-TOF-MS和ClinProTools方法组成的ClinProt系统,检测贲门癌高发区贲门癌患者血清蛋白表达谱,并建立与贲门癌患者密切相关的血清蛋白诊断模型,进一步落实贲门癌的综合防治措施,探讨可能与贲门癌预后有联系的候选血清蛋白就是有力的依据和手段。材料与方法采用家访和问卷调查、住院病历核查以及电话随访等方法,收集整理2006年10月～2008年12月在林州市中心医院和河南安阳市肿瘤医院住院接受手术治疗的贲门癌患者的临床病理资料和部分随访结果,共入选贲门癌447例。调查内容包括患者诊断年龄,首发症状及持续时间、临床病理类型、组织学类型及分化程度、TNM分期、家族史等临床病理资料。取贲门癌患者(GCA)18例,正常对照组20例,收集血清经Clinprot磁珠纯化、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析建立相应的蛋白质指纹图谱,采用ClinProTools生物信息学方法对其血清蛋白表的达谱进行研究。通过对不同质荷比(M/Z)的差异蛋白与数据库进行比对分析,筛选出与贲门癌发病相关的血清候选蛋白。抽取有明确生存期的贲门癌患者38例,分为生存期≤1年组,生存期≥3年组,收集血清经Clinprot磁珠纯化、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)组成的Clinprot系统分析建立相应的蛋白质指纹图谱,应用ClinProTools研究两组患者血清蛋白表达谱。利用ClinProToolsTM建立不同生存期的贲门癌患者的血清差异蛋白平均图谱,运用分析软件Clinprotools 2.1分析组间差异。主要结果1.河南林州地区贲门癌临床病理特征及生存分析贲门癌患者447例,其中男性334例,女性113例；男女比例为2.96：1。贲门癌患者的平均诊断年龄58.60±8.80岁。男性患者平均诊断年龄57.47±9.04,女性患者平均诊断年龄61.97+8.05,男性发病年龄较女性早(t=-0.52,P=0.05)。447例贲门癌患者中,51.0%(228/447)的患者首发症状表现为进行性吞咽困难,25.1%(112/447)的患者首发症状表现为上腹饱胀不适,68.9%(162/228)进行性吞咽困难的患者症状持续时间在2月以内。贲门癌447例患者中,各年龄组中首发症状持续时间在8天至30天所占的比例最大(152/447)。各年龄组贲门癌患者TNM分期构成中TNMIII期所占的比例最大(265/447)。贲门癌447例患者中,72.7%(334/447)患者在就诊后发现淋巴结转移(包括影像学和手术后证实),仅27.3%(113/447)患者未发现淋巴结转移。有明确病理类型者418例,其中早期贲门癌患者占14.4%(60/418),中晚期贲门癌患者占85.6%(358/418)。96.7%(58/60)的早期贲门癌患者大体病理类型为隆起型,中晚期贲门癌患者最常见的大体病理类型为溃疡2型,占70.7%(253/358)。有35.8%(160/447)的患者家族中存在2个或2个以上(包括患者本人)食管癌或贲门癌患者。恶性肿瘤家族史与贲门癌诊断年龄差异无统计学意义(t=0.608,P=0.889)。在贲门癌早期到中晚期患者的患病情况与诊断年龄相关性较弱(P>0.05)；与其是否有有恶性肿瘤家族史无明显的相关性(均为P>0.05)与其父母或是爱人患恶性肿瘤的情况相关性也不明显(P>0.05)；但患者家族史中食管癌贲门癌患者的情况与患者的相关性相当明显(χ2=4.84,P=0.036),大体类型为中晚期的食管癌贲门癌家族史阳性率明显高于早期大体类型。患者的诊断年龄与组织学类型无明显的相关性(P>0.05)。贲门癌患者的诊断年龄与患者肿瘤的分化程度无太大关系(P>0.05)。贲门癌患者的诊断年龄与患者的肿瘤分化程度的相关性不强(P>0.05)。其肿瘤分化程度与家族恶性肿瘤史、家族食管癌贲门癌史均无明显的相关性(均为P>0.05)。2.应用ClinProt系统分析贲门癌患者与正常人差异表达蛋白质谱图运用液体蛋白芯片飞行时间质谱系统检测贲门癌患者血清蛋白表达谱,与正常人比较,在责门癌组中筛选出13种蛋白表达上调,质荷比M/Z值分别为：M2369.93Da、M2066.42Da、M4980.31Da、M2128.37Da、M4964.22Da M4645.87Da、M2394.7Da、M4112.16Da、M8605.08Da、M4591.45Da、M4299.37Da M2444.97Da、M2899.63Da;7种蛋白表达下调,质荷比M/Z值分别为：M1865.35Da、M1778.51Da、M1694.73Da、M1881.32Da、M53337.59Da、 M5352.67Da、M1450.46Da。以质荷比M/Z为M1865.35Da、M1778.51Da的2种蛋白质作为分类变量建立分类预测模型,得到的平均值标准差、血清蛋白平均谱图及差异蛋白表达的样品分布图,该2个蛋白峰在贲门癌组均值丰度明显小于正常对照组,蛋白峰均值丰度在两组血清样本表现为具有显著分布差异。3.贲门癌患者生存期相关血清蛋白分析在贲门癌患者血清中,随着生存期延长呈明显升高趋势的蛋白质核比有22种,其中质核比4112.16Da、4591.45 Da的蛋白表达上调并同时随生存期的延长明显增加；质核比6649.86Da、8131.92Da、8288.51Da、3380.05Da、3472.8Da、 3491Da、3505.84Da3772.08Da、5448.65Da、5988.04Da、2070.24Da、3446.47Da、 3565.12Da、4067.61Da、4398.36Da、4744.17Da、6450.97Da、6609.99Da、6811.24Da、 8937.92Da等20种蛋白随着生存期延长呈明显降低趋势：在贲门癌患者中表达下调并且有利于生存的蛋白有2种：1866.57Da和1779.25Da；在贲门癌患者血清中特异表达并且不利于生存的蛋白分子量为4067.61Da和5448.65Da。在SWISS-PROT蛋白数据库中检索查询与其相匹配的蛋白质,作为预后相关的候选蛋白。结论1 贲门癌患者平均诊断年龄为58.60±8.80岁,男性多于女性,男性发病年龄较女性早。一半以上患者首发症状为进行性吞咽困难,但年轻患者首发症状常表现为上腹不适、上腹痛等。大体病理类型为隆起型者就诊早,溃疡型者就诊时多为中晚期。具有和不具有恶性肿瘤家族史的患者在诊断年龄,病理分型,大体分期和分化程度方面均无明显差异。2 ClinProt系统作为研究蛋白表达图谱的工具,具有较好的重复性和精度；13种蛋白在贲门癌中表达上调,7种蛋白在贲门癌中表达下调,这些蛋白可能为潜在的贲门癌肿瘤标志物。3运用ClinProt系统检测出M/Z为4112.16Da、4591.45Da、1866.57Da和1779.25Da的4种贲门癌患者血清表达蛋白峰可能是有利于生存的分子指标；4067.61Da和5448.65Da贲门癌患者血清中表达的蛋白峰可能是不利于生存的分子指标,这些蛋白峰可作为判断预后潜在的生物学指标。