美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.Piscicida)的分离、鉴定及其灭活疫苗的免疫保护性

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美人鱼发光杆菌是引起鱼类“巴斯德氏菌病”的病原菌,它不但宿主多样,致病性强,而且影响范围广泛,使得欧洲、北美洲、日本的海水养殖业遭受了严重的损失,并且该病在近几年已经蔓延到中国部分地区。本文描述了从白星笛鲷和卵形鲳鲹分离到的2株美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(分别被命名为PDS株和PDJ株)的一些生物学特性,其中主要对其致病性和胞外产物的酶活性进行了测定和分析。最后针对该病原菌开发了灭活疫苗并从多方面验证了疫苗的保护效果。 2株美人鱼发光杆菌胞外产物(ECP)的酶活性分析表明,其胞外产物均具有酪蛋白酶和磷脂酶活性,但是无脂酶、脲酶和淀粉酶活性。酪蛋白酶活性在20~28℃时最强,添加PMSF和EDTA能微弱地抑制其活性,而二价金属离子(Mg2+、Ca2+)则能够微弱地增强其活性。另外胞外产物对花尾胡椒鲷、斜带石斑、美国红鱼和卵形鲳鲹的红细胞均无溶血作用。16s rDNA测序比对再结合其不能生长于TCBS培养基上的性质可以判定2株菌均为美人鱼发光杆菌杀鱼亚种。 将PDS和PDJ2个菌株分别经腹腔注射接种白星笛鲷、紫红笛鲷、断斑石鲈和斜带石斑,结果显示2菌株对4种海水养殖鱼类均有较强的致死作用。作者进而选取了白星笛鲷对PDS株进行毒力回归实验并构建攻毒模型,测得半数致死量为73.5 CFU/g,低于其对紫红笛鲷的半数致死量7.47×103 CFU/g。对军曹鱼进行腹腔攻毒发现PDJ株对军曹鱼的半数致死剂量为6.14×104 CFU/g,而PDS株则高达2.53×107 CFU/g。之后分别用PDJ株和PDS株对白星笛鲷进行攻毒得到半数致死量分别为7.91×105 CFU/g和1.30×107 CFU/g,因此得出PDJ株的毒力要强于PDS株。 作者选择强毒PDJ菌株作为种毒制备针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的灭活疫苗,对军曹鱼苗进行腹腔注射免疫,然后进行定期攻毒试验,测定其免疫保护率、抗体滴度以及细胞吞噬活性,籍此对疫苗的最佳抗原浓度、配方和佐剂进行筛选甄别。结果表明,浓度为3×109 CFU/ml与3×1010 CFU/ml的全菌灭活抗原具有较高的免疫保护性,其平均相对保护率分别为55%和60%,二者间无显著性差异(P≧0.05)。而3×108 CFU/ml菌体抗原的免疫保护性显著低于前两者(P≦0.05),只有15%。对军曹鱼注射不同成分和佐剂的疫苗后第8周时攻毒发现,菌体+白油佐剂组的平均相对保护率为70%,菌体+ECP+白油佐剂组的保护率为80%,菌体+铝胶佐剂组的保护率为25%,菌体+ECP+铝胶佐剂组的保护率为50%。方差分析可知2个白油佐剂免疫组的保护率没有明显差异,但明显高于2个铝胶佐剂组;同时对第8周各组的抗体滴度进行方差分析得出2个白油佐剂组抗体滴度显著高于2个铝胶疫苗组。第12周的攻毒结果显示,只有全菌+ECP的2个组还具有保护效果,相对保护率分别为15%(白油佐剂)和20%(铝胶佐剂),说明在疫苗中添加ECP可以在一定程度上延长保护期。用PDJ株制作的全菌白油佐剂疫苗免疫白星笛鲷,30天后用PDS株进行攻毒,相对保护率为60%。以PDS株灭活菌液作为抗原测定白星笛鲷抗体滴度发现,PDJ株灭活疫苗免疫白星笛鲷产生的抗体能与PDS株抗原产生交叉反应,抗体滴度在30天时达到最大值32。
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